查看完整版本请点击这里：
【求助】Western blot 24kd的蛋白，我的结果是这样的
【求助】Western blot 24kd的蛋白，我的结果是这样的
我的目的蛋白是24kd,我做Western Blot的主要步骤是：
1.电泳浓缩胶80V，分离胶100v
2.转膜250mA，1.5 h，bio-rad湿转
3.丽春红染色能看到明显的Actin条带，和较淡的目的蛋白条带
4.封闭：5%脱脂奶粉室温，70rpm摇动2.5h
5.一抗（Santa Cruz多克隆羊抗人）1：400稀释
6.TBST洗膜15min，3次
7.二抗，兔抗羊1：4000，室温70rpm摇动1.5h
8.TBST洗膜15min，4次，
9.ECL显影定影，
结果背景太高，目的条带可以看到
考虑过是抗体问题，但目前换抗体这个选择已不太可能，只能硬着头皮继续用它，请高手提点意见怎么优化一下？
请教：这是什么原因啊，急，求高人解惑啊！！
查看完整版本请点击这里：
【求助】Western blot 24kd的蛋白，我的结果是这样的
【求助】Western blot 24kd的蛋白，我的结果是这样的
45381521.jpg
最新回复
ero11 (2014-3-10 10:48:40)
QUOTE:
一抗/二抗浓度过高tuuu2 (2014-3-10 10:49:01)
你这些结果很难让人信服的相信在19-26之间的就是你的目的带，因为在35kd处的杂带比下面的带还重，一抗可能确实存在问题，如果你坚信是背景的问题，可以适当增加TBST中Nacl的浓度，提高洗膜的效果，再作分析。
jkobn (2014-3-10 10:52:23)
QUOTE:
我这个可能是上样总蛋白太高导致胶跑不动引起的，我这次是上了大约300ug的总蛋白，因为以前试过很多次，50ug，100ug，150ug，200ug，总觉得上样总蛋白提高了，目的条带才更清楚了，所以这次上了300ug的，这也是背景太高原因吗？
另外。这次一抗只孵了目的蛋白的，并没有actin的；
胶可能也有问题，浓缩的不好，最近刚重配了1.5M Tris-HCl，0.5MTris-HCL，10%sds，希望会好点
我这种情况封闭时间要不要调整啊，其他人做的好像封闭就1h，一抗室温1h，洗膜也没我洗的时间长，可就是比我干净，到底是哪里的问题？？？
jkobn (2014-3-10 10:55:50)
今天又做了一次，表面看电泳跑的不错，跑完还是250mA，1.5h转膜，转膜后，临时去别的实验室要了点考马斯亮蓝染胶，（实验室比较简陋，很多东西缺，汗！）发现胶上还有条带，比丽春红染的膜上的淡点，这样我是不是应该调整转膜条件，只有湿转的机子，该如何调整啊，增加时间？
@STAR@ (2014-3-10 10:56:22)
ritou1985 (2014-3-10 10:56:51)
二抗是KPL公司的兔抗羊，我正准备再稀释二抗浓度试试；
如果封闭用5%BSA的话，一抗二抗也可用这个封闭液稀释的吧？
u234 (2014-3-10 10:57:15)
建议你用兔血清封闭。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=10238941&sty=3')
ritou1985 (2014-3-10 10:57:43)
再问下，我一抗羊抗人的，二抗兔抗羊的
如果用兔血清作为封闭液（博士德买的即用型，可以吗？），一抗用什么稀释，兔血清？
那二抗应该用什么稀释啊？
c86v (2014-3-10 10:58:52)
二抗是KPL公司的兔抗羊，我正准备再稀释二抗浓度试试；
如果封闭用5%BSA的话，一抗二抗也可用这个封闭液稀释的吧？
......
==============================================================================================================
个人认为是一抗时间过长引起的。以前因时间问题，让一抗过夜，结果背景很高。改成一抗室温1h，问题解决。你也可以用PBST多洗几次，30min吧，每次5min，背景会有所降低。
另一可能原因是你的一抗二抗比例不合适。
ritou1985 (2014-3-10 10:59:46)
一抗室温一小时试过的
没有用
orangecake (2014-3-10 11:00:28)
改一、二抗浓度
孵育完成后洗时间延长
封闭液奶粉增加到10％试试！
plaa (2014-3-10 11:01:11)
想要背景低 可以在二抗中加0.1%SDS
kuaizige (2014-3-10 11:01:27)
给你我的条件，我做的是26KD的蛋白，跑12%胶80V，约20分钟，110V约40分钟（根据MARKER调整），湿转300MA 一小时，膜洗一下PBST 5MIN，5%脱脂PBST封闭室温两小时，进冷柜两小时左右，一抗约1：500（我也是SANTA，其包装是1ML的故其效价相当于1：2500左右）4度过夜至第二天夜六点（时间很长，请注意这是我个人的方法），洗膜PBST 10MINX3，二抗室温一小时，再洗膜10MINX3，ECL发光。
我强烈建议你照我的一试。另外我上抗体一律用脱脂牛奶稀释。
我是临床医师，意见仅供参考。但这是我做了20多次WB的心得，我的结果还是可以的，基本看不到背景。
祝好运！
小野花 (2014-3-10 11:01:57)
【1】同意“楼上战友的背景高的首要原因是一抗是多抗的说法。一般多克隆抗体的背景要高于单克隆抗体。
【2】增加封闭时间，摇床室温4小时。
【3】一抗用5%脱脂奶粉稀释，这对降低背景挺有用的。降低一抗浓度或者减少一抗孵育时间。
【4】减少二抗的孵育时间。一般二抗室温摇床孵育1小时就可以了。降低二抗的浓度。
【5】不知道你一张膜是只作目的蛋白还是抗体洗脱后再做内参。如果制作目的蛋白，那可以把膜剪的窄一些，这样很多条带就没有了。
ukonptp (2014-3-10 11:02:18)
使用santacruz的抗体是要有些技巧的，
宁可从1：1000做起， 也不要从1：500做起， 否则满膜条带只会废了这张膜，
另外一个问题， 是二抗，
我用过7，8个SC的一抗， 除了一些表达量不是特别高的蛋白， 其实一抗1：500和1：1000很多时候没什么大差别， 关键二抗浓度肯定不能高， 否则哪怕你一抗1:1000甚至更低，仍然满膜条带。
【求助】Western blot 24kd的蛋白，我的结果是这样的