【求助】封闭过头如何处理?

最新回复

• hold住 (2014-3-10 11:11:24)

  
  我们都是用5%脱脂奶粉，37°封闭1h，效果很好啊！

• duoduo (2014-3-10 11:12:45)

  
  我的就是封闭过头了,然后显色时很浅很浅

• queen (2014-3-10 11:13:13)

  
  我一直用2%的BSA（用washing buffer溶解，同时添加0.09%的叠氮钠，保存在4度），常温封闭一个小时，从未出现过lz所说问题，建议lz尝试。
  附几点说明，首先，很多人为了省钱，喜欢用奶粉代替bsa，其实如果做成杂交袋，bsa花不了多少钱，算算成本比把牛奶倒在盒子里要小，牛奶即使加了防腐剂这样也用不了多久，不同时间的做实验还会增加实验的不确定性，最明显的就是，容易出现高背景。其次，如果非要用牛奶，建议充分混溶后再用，最好超声波后分装保存在-20度，用前可以低速离心去除大的颗粒，因为蛋白溶胶在小于1万g的转速下是不会沉淀的，最后，抗体稀释最好也用blocking buffer，为了和封闭的体系一致，一抗为了回收，blocking中要加防腐剂， 二抗为了不影响酶的活性，不加防腐剂，无菌滤器过滤后分装冻存在-20比较合适。祝好运。

• rxcc33 (2014-3-10 11:14:14)

  哇,楼上说的真专业!!太感谢了!
  但我依旧有个小小的问题,难道洗涤BUFFER和封闭BUFFER不一样吗?我的都是一样的,只是封闭BUFFER是在洗涤BUFFER里加了脱脂奶粉而已.
  多谢啊~~

• 箭头儿 (2014-3-10 11:14:39)

  
  建议5%奶粉封闭1h

• queen (2014-3-10 11:15:58)

  
  所谓的blocking buffer和washing buffer不过使一个称谓而已，其中的缓冲对，我们暂且不去管他，关键在于抗体的孵育过程中，前后的溶剂体系最好要保持一致，对于blocking buffer，其中的关键成分是BSA或者脱脂奶粉，对于一抗或者二抗，其中的关键使抗体，使用同一种溶剂，即washing buffer有利于溶剂间分子的平衡，洗膜和孵育的过程就是一个新溶质代替老溶质在膜上达到平衡的过程，这样实验的体系比较稳定一些。

• wmp1234 (2014-3-10 11:17:37)

  
  就是5%的脱脂奶粉，1小时以上。
  头一次听说封闭过头的
  一抗的问题吧

• caihong (2014-3-10 11:17:56)

  曾经摇床冰盒过夜封闭，结果未受影响。建议增加封闭后的洗脱时间。

• wood533 (2014-3-10 11:18:34)

  
  一般不会封闭过头吧，找找其它原因吧

• she (2014-3-10 11:22:31)

  
  是的。5%脱脂牛奶室温封闭1-2小时，不会过头的，一般估计一抗有问题，你做个不同浓度一抗的点杂交试试！

• any333 (2014-3-10 11:22:55)

  
  我封闭是用PBS来溶解牛奶的，洗脱时用T-PBS（加0.1%吐温），这样可以降低背景的说。

• vvmmoy (2014-3-10 11:26:16)

  
  我有时候懒得做了，丢在牛奶里过夜。只要牛奶没干，没事。可以看抗体说明书，封闭液也有很多种，可以根据说明书选择，常用5%脱脂牛奶。

• huifeng0516 (2014-3-10 11:27:01)

  
  我封闭后都不洗，直接加一抗也没事，有时候封闭过夜呢

• tie8 (2014-3-10 11:27:24)

  
  最近不知道什么原因，做Western总是高背景，ECL发光剂点上膜后，目的蛋白整张膜都发荧光，但我做的内参却很好，请教一下这是什么原因啊？？

• INK (2014-3-10 11:27:49)

  
  楼上的问题，可能有两个原因：1.一抗没有洗干净，可以延长洗膜时间；
  2.二抗有问题，你用的什么二抗，试试别家的吧。
  高背景还有可能是封闭不够
  似乎大家封闭的时间都很短
  我通常用脱脂牛奶封闭后放在4度过夜或者室温封闭4小时

• redbutterfly (2014-3-10 11:28:08)

  
  加长洗膜的时间和次数

• ritou1985 (2014-3-10 11:31:36)

  我试过延长洗膜时间，PBS洗膜三次，10min一次，还是出现一样的情况。
  我的二抗原来做都没有问题的，换了别家的二抗，还是没有作出来目的蛋白。急啊！

• 8princess8 (2014-3-10 11:32:14)

  我一直用2%的BSA（用washing buffer溶解，同时添加0.09%的叠氮钠，保存在4度），常温封闭一个小时，从未出现过lz所说问题，建议lz尝试。
  附几点说明，首先，很多人为了省钱，喜欢用奶粉代替bsa，其实如果做成杂交袋，bsa花不了多少钱，算算成本比把牛奶倒在盒子里要小，牛奶即使加了防腐剂这样也用不了多久，不同时间的做实验还会增加实验的不确定性，最明显的就是，容易出现高背景。其次，如果非要用牛奶，建议充分混溶后再用，最好超声波后分装保存在-20度，用前可以低速离心去除大的颗粒，因为蛋白溶胶在小于1万g的转速下是不会沉淀的，最后，抗体稀释最好也用blocking buffer，为了和封闭的体系一致，一抗为了回收，blocking中要加防腐剂， 二抗为了不影响酶的活性，不加防腐剂，无菌滤器过滤后分装冻存在-20比较合适。祝好运。
  ......
  
  =========================================================================================================
  
  封闭牛奶用你说的这种方法的话确实很“浪费”！不过，我们的做法是每次用之前配，只配当次用的量，封闭时用杂交袋封闭，也很省的！