【求助】请教2D-Gel

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-10 15:06 作者: mybioon 来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】请教2D-Gel

鱼肝脏。1:9 提取液，9 M urea, 2% (w/v) CHAPS, 25 mM Tris–
HCl pH 7.5, 3 mM EDTA, 50 mM KCl, 50 mM DTT, 2%
(w/v) Resolytek [Merck], 40 AM leupeptin。 15µL+115µL水化液上量
水化16h
7cm pH4-7 胶条
IEF （开始没有接触好,到后来发现电压最多到2500V检查发现的)
200 V 1 min, 线性到5000V r 1 h 30 min, 固定5000 V for 1 h 50 min
SDS胶10%
（配了4，5 次胶，都很难凝固，最后一次也是等了2个多小时才凝的）
胶体考染染色过夜（没有固定，就用水冲了一下，就放在染色液里）
请大家提意见，我的蛋白酶有定量，好像加了表面活性剂提取的，用Bradford定量也不准确，是不是还可以再多上样一倍？
谢谢。

查看完整版本请点击这里：
【求助】请教2D-Gel

60975955.jpg

我也来说两句查看全部回复

最新回复

mybioon (2014-3-10 15:12:28)

今天作了24cm胶条IEF, 同样的提取液，200µl+250µl水化液，设置为
200v 1h, 500v1h, 1000v1h, 8000v 9h,可是IEF得电压根本上不去，从50v左右开始，过了5个小时后还是130v，后来想了一下，可能因为提取液中用了50mMkCl, 7cm 胶的时候只用了15µl，所以没有问题，24cm 上样量多了，盐浓度太高了，不知道我这样分析对不对，现在我准备就让它自己慢慢升高跑过夜，到明天看它能达到多少电压。是不是总的kVh到了也可以啊。请大家指教。
tangxin_80 (2014-3-10 15:12:45)

1，蛋白定量除了Bradford还可以用其他方法嘛，如BAC、LOWRRY，否则你得进行多少次预实验摸索才能得到满意的图谱呢？
2，电泳结束后固定是分必要，考染上样量大，固定过夜还觉得点不够锐利，不固定恐怕弥散得很厉害。
3，关于电压上不去，盐离子的确是一种干扰。建议你样品处理完定量，除盐。
祝早日跑出漂亮2D图谱。
mybioon (2014-3-10 15:13:27)

1.这次没有定量，有了2D quantkit, 下次跑比较样品的时候肯定要先定量的。
2.这次固定了，3x5min水洗后胶体考染。
3.电压后来是上去了，但是到凌晨3点才跑好，做出来的胶也有明显的横条纹，我想是和盐有关的。不知道文献上用50mM KCl干什么，我下次提取蛋白的时候把这个取消不放了，应该没有问题吧。
上次说了5个小时才到100多，不过电压后来到是升上去较快了，一个小时内上到了1000V, 1000V固定了1个小时，又花了几个小时上到8000V，然后固定8000v，8个小时，总电压为79kvh。
这是数码相机拍的照片，24cm pH3-10NL, 左边是＋，右边那一条是标准蛋白，不过看不清，请大家提意见。

59374282.jpg
mybioon (2014-3-10 15:13:46)

这是imagescanner扫描的图

49289352.snap.jpg
mybioon (2014-3-10 15:14:12)

怎么没有人提建议，自己顶一下，除了横条纹，其它都貌似还行。左边是正极，应该是pH10端。
mybioon (2014-3-10 15:14:49)

没有人提意见，我问了一下同事，横条纹除了含盐量高还可能有是因为提取蛋白中的膜蛋白难溶于IEF buffer造成的，我买了2Dquant kit和2Dclean-up kit, 准备先比较一下用clear-kit何不用的区别，条件摸熟了后再买24cmprecast gel上正式样品，我是做不同条件下的鱼的肝脏蛋白的比较找差异，请问如果有两个样品要比较，该如何设计实验呢？我看文献上都是3个replicate, 那也就是说要做6张胶，对吗？那6张胶怎么比较呢？请大家指教，谢谢。
redbutterfly (2014-3-10 15:15:22)

样品不定量是不行的，2D Quant Kit挺好用的。样品中的盐分太高了，如果不重新作样品的话就搭上滤纸低电压除盐。CleanUp最好不用，那东西重复性有点问题。6块胶拿软件比啊！
喵咪 (2014-3-10 15:15:44)

肯定要定量啊，保证上样量一致才能比较蛋白点量变化差异。
所有平行实验结果用软件分析，Imagemaster或者PDQuest，找出差异点挖点做质谱鉴定。
以上应该才是完成第一阶段工作，呵呵！
mybioon (2014-3-10 15:16:24)

谢谢，是要定量，不过是先用2D quant kit定量呢，还是先用2D clean kit除盐呢
mybioon (2014-3-10 15:17:09)

再来接着请教，我做的是多宝鱼（Turbot)的肝脏, 我从上面那个叫上切了10个点作了LC/MS/MS, 但是在搜数据库的时候不清楚该怎么做？是不是turbot的genome没有就没有办法进行搜索啊？请大家指教，谢谢。