【求助】背景太高怎么办

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• 喵咪 (2014-3-10 17:31:50)

  是否一、二抗均放在5％的脱脂牛奶里？
  用的显色底物是安玛西亚的吗？如果是的话，可以考虑换pierce的

• 二丫头466 (2014-3-10 17:32:08)

  
  二抗浓度是否做过优化，考虑试一下，1：5000，1：10000，或者更高。如果二抗质量好，一般做WB，ECL显色，工作浓度基本都可以达到1：10000.
  一、二抗均放在5％的脱脂牛奶，对降低背景有些作用，但绝不是根本原因。

• wmp1234 (2014-3-10 17:32:27)

  
  你的抗体是不是回收利用的？换新配的试试

• kuaizige (2014-3-10 17:32:48)

  
  降低二抗的比例，延长洗脱时间，我以前洗过4、5个小时，感觉还不错的样子

• DONT (2014-3-10 17:33:05)

  
  在稀释一抗和二抗时，加入0.1%的SDS，可以降低背景，再有就是洗脱时间和次数可以多一些，

• kewanqi2011 (2014-3-10 17:33:26)

  可以增加洗脱时间和次数，我用TBST洗6次，15min/次。祝好运

• 2541 (2014-3-10 17:33:44)

  延长封闭时间，提高牛奶浓度，加ｔｗｅｅｎ－２０

• DONT (2014-3-10 17:34:06)

  【1】最可能的原因就是封闭的不够。建议延长封闭时间，我是5％脱脂奶粉室温摇床上封闭4小时，奶粉一定要溶好，要完全溶解，没有沉淀。你的一小时似乎有些短了。
  【2】适当降低二抗的浓度。不知道你的二抗的建议稀释比例是多少？我有一个二抗的建议稀释比例是1：2000－100000。如果你的建议稀释比例也是这么大，那么就大胆的降低二抗的浓度。
  【3】TBST 洗涤时用的器具要干净。这一点也挺重要的。
  【4】如果上样量过大，蛋白浓度过大会产生上述现象的。减少上样量或者降低蛋白浓度，这也是挺重要的一步。不知道你的上样量和蛋白浓度时多少。一般上样量在20－100微克左右比较好。
  【5】适当减少放在ECL中的时间。

• yonger (2014-3-10 17:34:48)

  
  我以前背景也高.
  用10%的奶粉+TBST(Tween-20终浓度0.5%) 配制封闭液
  一抗二抗,用TBST配制(Tween-20终浓度0.05%)
  TBST洗膜(Tween-20终浓度0.5%)
  一般背景应该很干净了,不行的话,就用10%BSA+TBST封闭,那样太浪费了

• whitesheep (2014-3-10 17:35:20)

  
  背景太高影响因素很多;
  一抗的好坏很重要,其次二抗的浓度不能太高,如楼上所讲.
  封闭 5%脱脂牛奶 RT 1hour 可以了, 可以4度过夜排除封闭原因.另外背景深和洗膜有很大关系,不要几张膜放在一个小容器里洗,摇晃过程中很容易粘在一起,影响洗膜效果.一抗后的洗膜不要太久,太剧烈,10min 3times 就可以了,二抗后的洗膜可以适当延长,我一般是10min *15min *15min 很少有背景,希望对你有帮助