【求助】为什么屡次β-actin都出不来

最新回复

• #甜# (2014-3-11 17:25:31)

  
  一抗二抗没问题吗？
  别人用的多久没用了？

• xyw5 (2014-3-11 17:25:54)

  
  先看看你的蛋白质量如何吧

• cj_mondy (2014-3-11 17:26:36)

  
  蛋白质量如何看呢？？
  我是提的细胞蛋白

• 33号 (2014-3-11 17:27:21)

  
  提取蛋白后看染胶有没有目的条带，量怎样，另外一抗二抗浓度是不是调整一下，会不会失效什么的。
  有时候按步骤做也未必能做出结果。

• cj_mondy (2014-3-11 17:28:08)

  
  膜上染的都有的
  郁闷的

• cj_mondy (2014-3-11 17:28:46)

  
  二抗用的是生物素标记的 看的丁香园里帖子 说生物素标记的二抗最好不用牛奶封闭 最好用BSA 有人用过吗 请问

• #甜# (2014-3-11 17:32:06)

  
  是最好不用牛奶封闭的；
  另外排除一抗二抗的质量问题，上样量过高也会的．
  调整上样量或一抗二抗的比例．
  我以前做组织的actin也是做不出，stripping后就有了，说明系统里的HRP过高，减少一些或许就出来了．
  为什么要压片那么久呢．

• cj_mondy (2014-3-11 17:32:29)

  哦 谢谢你 总是失败 听他们讲就试试的 压片长了会怎么样呢
  我可能知道我问题出在那了 我二抗是生物素标记的 但发光剂是买东西送的 是辣根过氧化酶标记的 我已经重新购买
  请问 如果是生物素标记的 我用什么来封闭呢

• ROSE李 (2014-3-11 17:34:39)

  
  用什么来封闭和二抗是什么标记的应该没有关系的，我一直是用脱脂奶粉封闭的都挺好的，背景也很干净。

• fei1226com (2014-3-11 17:36:09)

  
  个人觉得有一下几个问题可以考虑一下：
  1、你的一抗、二抗浓度用的是什么公司的？怎么会要这么高的浓度呢，我用santa cruz的抗体，一般一抗浓度用在1:1000-1:2000作用，二抗一般用的1:3000或者1:5000。
  2、压片时间似乎也有问题？你压3个小时是说明书上这样建议的，还是你师姐之前做实验摸好的条件？一般情况下，如果在暗室下，肉眼能看见荧光，那么压片15－30s就足够了，如果肉眼看不到可以压片10min-30min，可以同时压2－3张片子。如果30min压出来的片子还是什么都没有，那么可以不用做了，继续分析原因吧。
  3、做之前有没有蛋白定量过？蛋白浓度多少？beta-actin应该是很好做的，一般的表达都会比较高。当然如果你做的是核蛋白，那么就另当别论了，因为beta-actin在核内不表达。

• loli (2014-3-11 17:36:30)

  
  立春红染出来了，你提的蛋白肯定没有问题，你的问题就是原来抗体是生物素标记的，可是ECL是要用辣根标记的，你要换二抗，另外，1：800的二抗估计是国产的，最好换进口的，跟别人要1微升，可以反复用数十次，我有几支捡别人用过的二抗用了一年多，没有什么做不出来的。封闭用1%-5%的牛奶都可以试一下，内参基本上都是最强的，抗体好的话，5%的牛奶是最好的选择。如果你一定要用生物素标记的二抗，那你可以试一下BSA或明胶封闭，浓度同样要摸一下，这种封闭效果比牛奶弱，容易出条带。

• cj_mondy (2014-3-11 17:36:53)

  
  谢谢 战友们帮我分析
  我换二抗了 但还是没有出来 有染了膜 仍可见清晰条带
  更郁闷了

• summerxx (2014-3-11 17:37:13)

  
  先排除一个最简单也是很关键的问题，你的抗体种属对应关系没有弄错吧

• cj_mondy (2014-3-11 17:41:23)

  
  没有弄错 都是抗小鼠的 今天做了 还好一点 有黑影 但只有一条 我是四组的 其他三组很弱 安慰了一点 总算出来点了 但其他条带丢了 不知道为什么

• cj_mondy (2014-3-11 17:43:30)

  
  谢谢大家了 今天终于出来了 呵呵 关键还是看抗体好不好啊 哎 进口的就是不一样啊