【求助】蛋白转过去了吗？

最新回复

• damingxia0904 (2014-3-12 15:40:42)

  
  写错了，是和旁边相邻的两条是一样的上样量，两种不同的蛋白。

• yonger (2014-3-12 15:43:38)

  
  电流、电压都没有说明。
  不过看胶的情况，明显转移不完全，你的分子量又大，多转会，不会过头的。

• damingxia0904 (2014-3-12 15:44:21)

  
  电流、电压都没有说明。
  不过看胶的情况，明显转移不完全，你的分子量又大，多转会，不会过头的。

• 831226 (2014-3-12 15:45:16)

  
  纠正你几个错误：
  1. 93Kda不算大蛋白，属于比较好转膜的区间，常规200KDa左右（不知道具体怎么界定，>150KDa也可以算大蛋白），才需要特殊的转膜方案
  2. 我在这个论坛上说过多次，不建议转膜后用立春红染色。A. 现在多数实验室已经用预染的Marker做实验，转膜情况如何只需要看看Marker的深浅。B.增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白并不好。C. 浪费时间。如果可以直接看Marker深浅指示转膜效果，何必再多此一举！？
  3. 1hr对于半干转来说已经很长了，当然我不清楚国产半干转仪的效果，如果是biorad的，通常0.5hr就好，这恰恰也是我们喜欢用半干转的原因，省时；湿转通常1hr（有人会说省转膜液，但是对于我们来说省时比省钱更有意义每天工作量太大了）
  有些不太好回答的地方，主要是可能存在的仪器差异：
  通常我们采用2.5-3mA/cm2，电压25V（biorad半干仪额定不能超过25V；通常也跑不到这么大电压，除非是新的滤纸或很久的转膜液，或常温放置的转膜液，或超大的胶），时间一般15--45min（常规用0.5hr）；如果是3mA/cm2，时间不要超过0.5hr。以上条件是millipore的经典条件（要相信这些老外的公司，如果它的条件不稳定，你可以起诉它），而且我们也用了4年多，很稳定。Semi-dry buff.就用分子克隆的就好。
  对于你的蛋白，由于是最适于转移区间的小蛋白，所以以上条件如果是在biorad半干转膜仪上一定能稳定运行，进口的应该都还好，国产的不好说（听说质量不好）。
  仍然有问题，发悄悄话给我。
  PS: 偶尔翻看了一下millipore的说明书，发现你采用的条件上面也有列出，但是在0.8mA/cm2的时候，它推荐是1-2hr，那么可能要到1.5hr-2hr才会稳定吧（但我不是很肯定，从来没有选择用过这个条件）；还是推荐你尝试尝试2.5mA/cm2，0.5hr很稳定的，除非你还有其他的问题。
  再次强调，立春红染色不能说明任何问题。早期尝试过，发现没有任何意义。即使染色不出任何东西，显影仍然正常。事实上，立春红的灵敏度和HRP-ECL显影体系的灵敏度相差太远太远了。（包括考染胶，也是灵敏度不够不能说明任何问题，做WB快6年了，从来不这么干）
  在cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=11496114&tpg=1&ppg=1&sty=1')的回复上，我有附实验效果图

• 66+77 (2014-3-12 15:45:44)

  “不建议转膜后用立春红染色，现在多数实验室已经用预染的Marker做实验，转膜情况如何只需要看看Marker的深浅？？“
  请问：转完膜后考染胶有必要吗？

• xyw5 (2014-3-12 15:46:09)

  
  我一般是转完之后把胶用考马斯亮蓝染一回 ，如果胶上干净了， 就说明转过去了。但是有没有转过头就不知道了。
  一开始摸转膜条件的时候就把胶一分为二，一半用来转膜，另一半专门用来染色，看未转膜的时候胶上有多少蛋白。转完膜的那一半蛋白也用考马斯染一次，这样就有个比较，知道转的前后多大差别，转过去了多少。
  愿有帮助。

• 89tongzijun (2014-3-12 15:46:38)

  
  今天转了一个半点，感觉还不错，就是最后出结果的时候没反应，同学说是因为我的上样量太大（100微克），因为整张膜都显色，就我要的条带是一道白线 ，明天少上点，50看看吧，谢谢大家指教！

• 831226 (2014-3-12 15:56:32)

  
  整张膜显影，应该是背景过高，调高一抗稀释液中竞争性的BSA或牛奶或Gelatin，或者加两种；或者降低一抗浓度。
  出现白线除了过量以外还有可能是保鲜膜边缘刚好压到那条带的附近，或者膜正面保鲜膜没有捋平，造成ECL堆积在那一条线状缝隙中，造成线条状的淬灭。总之这都是淬灭造成的（抗原过量同样淬灭）。所以你应该把图片传一下看看，再说。如果真的如你所说一道白线，那就是局部淬灭。

• damingxia0904 (2014-3-12 15:57:55)

  条带如下

  
  98735260.snap.jpg