【求助】WB重复时洗片无任何东西，请大家帮忙分析

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• ladyhuahua (2014-3-12 16:34:34)

  这两天天次发光后胶片什么都没有，actin也是。
  这个问题大了，你仔细想想每个步骤啊，有没有变化的。
  既然你以前出来过结果，那么问题不会出在抗体上啊。
  抗体怎么放的？连actin都没有！！

• hold住 (2014-3-12 16:34:56)

  
  
  转膜条件有没有变化？
  转完膜，看看你的冰盒里的冰还有没有？如果是湿转的话。
  一定要确保在4度下转，如果冰盒里的冰化了，那么温度就会升高，那么转的效率就不一样了。
  转完膜后，用考马染一下胶，再者，也用立春红染一下膜啊。

• 2541 (2014-3-12 16:35:24)

  
  抗体按要求放-20度冰箱，之前也是这样放的，应该没问题！
  actin也没出结果！

• hold住 (2014-3-12 16:35:58)

  
  还有啊，你的上样量怎么这么高？目的蛋白表达丰度如何？含量很少吗？

• 2541 (2014-3-12 16:36:16)

  刚想起来了，唯一的改变是新配了30%丙稀酰胺溶液
  丙稀酰胺 29g
  甲叉双丙稀酰胺 1g
  加双蒸水37℃溶解,定容至100mL,棕色瓶室温保存。
  较上次不同的是加的去离子水，在烘箱60度溶解的……
  SDS电泳时，观察预染的Maker，也没看出太大异常呢。
  这是原因？

• 2541 (2014-3-12 16:36:35)

  
  就是换了30%丙稀酰胺溶液，其他的都没变。

• NBA (2014-3-12 16:37:06)

  目标蛋白 SYN 38KD
  实验方案是：
  1、分离胶12%、积层胶5%
  2、上样25ul 蛋白浓度75ug/ul
  3、转膜 200mA 2小时 湿转 Bios电泳系统
  4、封闭 5%脱脂奶粉TBST溶液 37度2h
  （跑两块同样的膜，因为目标蛋白和Actin分子量相距只有5kd）
  5、A膜 一抗 santa cruz产品 1：1500 室温轻摇3h/B膜 Actin santa cruz产品 1：1000 室温3h
  6、洗膜 TBST室温轻摇15min*3
  7、二抗 KPL产品 1：3000 室温轻摇1h
  8、洗膜 TBST室温轻摇15min*3
  9、ECL发光
  两天前做了三次结果各方面都不错，
  这两天天次发光后胶片什么都没有，actin也是。
  各位帮一起分析下原因吧！~谢谢。
  ......
  
  =============================================================================================================
  
  【1】哈，既然做了三次，结果个方面都不错，就不要再做了，要这三次的结果就可以了。
  【2】你蛋白是怎么取的？是组织还是细胞的蛋白？具体的量，还有裂解液和蛋白酶抑制剂的量怎么样？蛋白浓度是怎么定的呢？是每次测都这个结果吗？还是就一次呀？多测几次吧。你算一下，你的上样量都有多少啦？25×75，这也有点太大了吧？
  【3】蛋白没有重新提取吗？没有换吗？怎么保存的，有没有降解的可能？
  【4】30%丙稀酰胺溶液既然重新配了，就还是按以前的配吧。以前怎么配，就怎么配吧.溶解完全吗？不过应该还是超纯水好呀（应该用超纯水配的）。有沉淀吗？如果有沉淀，可以用滤纸过滤一下的。以前的30%丙稀酰胺溶液是自己配的吗？
  【5】转移液有重新配吗？转移液最好用新的。你一般都是用几次呀？一般建议可以用3－5次，我感觉最好用1－2次。可以配成10×的，每次用取100毫升，然后稀释成1000毫升就可以了。
  【6】当然分离胶配成12％的也可以。不过38KD的还是10％的胶更好一些。
  【7】再想想还有没有什么是变化的。有些时候有些东西变了，是很难察觉的。

• 2541 (2014-3-12 16:37:37)

  【1】哈，既然做了三次，结果个方面都不错，就不要再做了，要这三次的结果就可以了。
  A：实验室要求高，老师盯着你做呢，得有十次结果。
  【2】你蛋白是怎么取的？是组织还是细胞的蛋白？具体的量，还有裂解液和蛋白酶抑制剂的量怎么样？蛋白浓度是怎么定的呢？是每次测都这个结果吗？还是就一次呀？多测几次吧。你算一下，你的上样量都有多少啦？25×75，这也有点太大了吧？
  A：组织蛋白，提取都正确的。25ul里面蛋白总量是75ug/ul。
  【3】蛋白没有重新提取吗？没有换吗？怎么保存的，有没有降解的可能？
  A：是组织，我一次性提好了，-20度保存，计划是放一个月的，现在快到了。
  【4】30%丙稀酰胺溶液既然重新配了，就还是按以前的配吧。以前怎么配，就怎么配吧.溶解完全吗？不过应该还是超纯水好呀（应该用超纯水配的）。有沉淀吗？如果有沉淀，可以用滤纸过滤一下的。以前的30%丙稀酰胺溶液是自己配的吗？
  A:这可能是问题之处。以前是自己配的，之前用的DD H2O，37度溶解，这次用的是去离子水，当时一下图快，在烘箱里溶解的，60度。。。。我真的怀疑这是原因！
  【5】转移液有重新配吗？转移液最好用新的。你一般都是用几次呀？一般建议可以用3－5次，我感觉最好用1－2次。可以配成10×的，每次用取100毫升，然后稀释成1000毫升就可以了。
  A：我的是5*的，再稀释，一般都用两次。
  【6】当然分离胶配成12％的也可以。不过38KD的还是10％的胶更好一些。
  【7】再想想还有没有什么是变化的。有些时候有些东西变了，是很难察觉的。
  A：换过了显影定影液，不过之前没做出的一次用过之前用的还是没有，试剂都是我自己配的……

• lxh031 (2014-3-12 16:37:59)

  我也遇到了楼主同样的问题，前两次都做出来了，这次却什么都没有，很是不解
  同时分别作了两张膜分别检测两种蛋白，蛋白1显影了，蛋白2却什么都没有，于是重新加了蛋白2的一抗和二抗（怀疑加一抗二抗时走神了，一抗二抗的原液没加到牛奶里），曝光时间完全同前，结果还是空白片子一张，真是不知道问题出在哪里？
  1，曾经怀疑检测蛋白2的膜转移出了问题，现在正在做内参看看（尚未曝光，正在做），但也不应该是问题，因为我用的预染MARKER都转到了膜上
  2，还有一点值得怀疑，因为蛋白2的抗体剩的不多了，仅有几UL，会不会抗体突然在前一次之后的48小时失效了呢。
  借用楼主的宝地，大家也给我出出主意，我也等着毕业的

• 8princess8 (2014-3-12 16:39:55)

  
  再问楼主你的第二点：
  蛋白浓度单位是不是写错了，25UL×75UG/UL
  那么你的上样量有多少啦？

• yjf1026 (2014-3-12 16:41:03)

  
  显影能看到荧光吗，如果有显不出来，那就是显影液的问题。我们碰到几次