【求助】帮我分析一下SDS-PAGE电泳失败的原因

最新回复

• fsdd817 (2014-3-13 16:54:20)

  
  都扩散了，时间太长了或产热太多。试试200v，30分钟

• 喵咪 (2014-3-13 16:55:05)

  
  胶没凝好 尝试延长凝胶时间

• vivian4123 (2014-3-13 16:56:07)

  
  1. 蛋白为什么没定量？上样量差别过大，容易跑的宽窄胖瘦不齐
  2. 看看你的第4-6条带，都跑成波浪了。（6是maker吧？）
  一般来说“U”型的波浪一般是由于胶凝结时间过短，梳孔两侧没有凝好的胶对样品有一定的“迟滞”作用。上样量过大也可能会出现“U”带；而像你这种“W”型的条带主要是拔梳子的时候带动了胶的底部，或者是由于胶的底部有未清除干净的胶而致；还有一种可能就是你的胶本来就没有配好，里面有杂质（比如说上次配胶后没有洗干净容器），一些杂质或者是气泡导致条带不平
  3. 另外就是跑的时候电压过高，容易（尤其是小分子蛋白）跑的歪歪扭扭的。不过你这个胶从上往下都是波浪，应该不是这个问题。
  4. 条带7是什么东东？貌似降解的很厉害似的。

• shenkunjie (2014-3-13 16:57:48)

  
  非常感谢各位大侠，我主要是水平确实有限，好多问题都不懂，所以很不好意思。左数第五条是mark为什么我的标准的第一条带总是跑不出浓缩胶呢？
  谢谢大家的帮助与支持！

• 小糖块 (2014-3-13 16:58:13)

  
  同志！！你的蛋白降解了
  第一，请在提蛋白的时候加蛋白酶抑制剂，提完了冻到负20（重要)
  第二，不要用太高的电压跑胶，会产生热的。建议80-85伏跑集成胶；120-140跑分离胶。跑过集成胶以后，可以放在4度电泳。（重要)
  第三，10%的APS新鲜配制以后，分装冻入负20（重要)
  第四，检测你的丙烯酰胺试剂有没有问题
  第五，电泳液，用一次就扔了，别舍不得。。。
  重新做吧，按上诉要求，等你好消息。

• 小糖块 (2014-3-13 16:58:46)

  
  还有，TRRI缓冲液的PH值特别重要，PH6.8和PH8.8的一定要调准啊！！

• fsdd817 (2014-3-13 16:59:20)

  
  你的胶的浓度是多少啊？试试提高胶的浓度，我的配方（分子克隆）：
  12%分离胶5ml（ddH2O 1.6ml, 30% acrylamide 2ml, Tris-HCl pH8.8 1.3ml, 10%SDS 50ul, 10% APS 50ul, TEMED 2ul), 5% 浓缩胶（ ddH2O 1.4ml, 30% acrylamide 330ul, Tris-HCl pH6.5 250ul, 10%SDS 20ul, 10% APS 20ul, TEMED 2ul ), 在配制胶时适当多加一点APS和TEMED，可加快胶的凝聚，一般分离胶/浓缩胶 30/30min即可

• tuuu2 (2014-3-13 17:00:11)

  你可以试试梯度胶，我这有