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【求助】考染的胶结果总不理想，请高手帮看看:(
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分子量150，为膜蛋白，从人结肠组织提取，负八十度放置了约两星期。配的是8%的分离胶。以前用的是自己的制胶溶液，这次用别人的，每次跑完胶，考染以后总是这个样子，请各位帮忙看看是否蛋白降解？
左上角那块偏白的是转过膜后的胶，最左边的泳道是Marker，我切的是120以上的部分。120以上的这部分胶条带有很长的纵向拖尾，没有看到横向的蛋白条带。只在下面那块没有转过膜的胶的下部分，可以看到隐约扭曲的横向蛋白条带，这是否代表着我切的那块胶上没有分离出来的蛋白？这样还能继续转膜做下一步的实验吗？我做过很多次，显影出来都没有条带。
焦急万分，恳请解答！
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gogo (2014-3-13 20:55:42)
我觉得2周，而且是-80度，没有那么快降解的。
是不是你配的溶液有问题啊？
其实跑胶还是比较容易的，重要的是后面转膜和一抗二抗。
你能把怎么配的溶液告诉我们，帮你分析一下。
079777chao (2014-3-13 20:56:02)
急啊~~各位给指点指点
079777chao (2014-3-13 20:56:34)
溶液：
2.3ml的去离子水，1.3ml的30%聚丙烯酰胺，1.3ml triscl （PH8.8），30ul 10%的SDS，30ul的AP，3ul TEMED，配成8%的分离胶。
我这样配的可以不？
079777chao (2014-3-13 20:56:55)
β-actin孵出来还可以，就是目的蛋白不出
leifengta (2014-3-13 20:57:58)
溶液：
2.3ml的去离子水，1.3ml的30%聚丙烯酰胺，1.3ml triscl （PH8.8），30ul 10%的SDS，30ul的AP，3ul TEMED，配成8%的分离胶。
你是配的5ML的分离胶吧？
你的SDS、AP应该加50UL，你在试试。
leifengta (2014-3-13 20:58:16)
还有你的上样量可能太多了。
你跑胶的时候样品又没出现笑脸状？
有的话就是样品的量太大了。
coolcool (2014-3-13 20:58:31)
从图上看上样量不算太大。
最好就是你在上样前最好离一次心，因为-80溶解后的蛋白会有一些析出来，我以前也遇到过这样的问题，离心后就行了。
还有跑的时候注意一下降温，最好是冰水浴，温度太高也会出现这种情况。
veiwu (2014-3-13 20:58:52)
从marker的条带来看，胶聚合不佳的可能性最大。其次注意7上样前样品要离心，去除不溶性颗粒。如果样品里面有不溶性的颗粒存在的话就很容易产生竖状条纹，俗称“鬼带”。
fqswdzd (2014-3-13 20:59:10)
1。离心你的样品
2。上样缓冲液理有杂质
3。丙烯酰胺没有过滤
079777chao (2014-3-13 21:01:04)
胶跑成这样，还能继续做下一步转膜等的实验吗？用恒压10伏，半干转80分钟，立春红染膜见到膜上也是竖状条纹。5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗1:400,二抗1：2000，做过很多次了，显影就是没有条带，抗体浓度也调整过。
请教各位！
coolcool (2014-3-13 21:01:21)
你的胶都没有跑好，虽然转膜成功了，但是对你的膜上蛋白
还是有影响的。你先把胶跑好再说吧。
我觉得可能是你的分离胶没有混匀、所以你的胶有点变形。
自己多做几遍，多摸索。
uuooii (2014-3-13 21:01:39)
我也来说两句吧
推荐你好好看看这个精华帖，非常的好
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=10521738&sty=1&tpg=1&age=0')
问题1：纵向的条纹
原因：a样品溶解性不好。处理样品后离心去除沉淀
b。凝胶面不平整。看你的胶图上面很明显的出现这个问题，不知你有没有用水或水饱和正丁醇封胶；如果有封胶的话，建议更换AP。
问题2：微笑（不是很明显）
原因：电泳中产热比较多。如果有条件的话可已放在冷库或者冰箱中跑。也可在电泳槽外面放置及格冰袋。再或者适当的降低电压。
问题3：前沿好像跑出去了 注意电泳时间的控制
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