【求助】疏水层析求助

最新回复

• cocacola (2014-3-13 21:21:16)

  有没有试过更高的硫酸铵浓度？有资料说一般1.75M以上，但是也要根据不同的蛋白，再提高点试试！

• xingyi08 (2014-3-13 21:21:49)

  我用的缓冲液是Tris-HCl，硫酸铵浓度为1.5M时不用加HCl其pH值就达到8.5，若硫酸铵浓度在提高的话pH不就要加碱调了吗？那可就不是Tris-HCl缓冲液了啊，我做的离子交换是用的pH8.5的Tris-HCl

• xingyi08 (2014-3-13 21:24:18)

  相关疾病：
  头痛
  各位高手有什么建议，请多多指教啊，现在过疏水柱真是好头疼，谢谢各位

• glass (2014-3-13 21:24:42)

  换个思路考虑一下。如果目的蛋白没有保留也是好事啊，就用冲洗条件进行冲洗、收集就可以了。不会杂蛋白也没有保留吧？不一定要目的蛋白有保留，才能作纯化；目的蛋白没有保留，杂蛋白有保留一样可以作纯化啊。主要看看收集的酶液的比活性有没有提高，酶活回收率可不可以接受就可以了。

• birdfish (2014-3-13 21:25:24)

  但是在上样后平衡的过程和洗脱过程中收集的每管样品（即使没有峰）都有酶活，而且活性很平均
  
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  1，你说的上样后平衡的过程是否指binding buffer的冲洗过程，还是sample application。如果是前者的话，首先要确保binding buffer中(NH4) 2SO4浓度和样品中一样或者比其高才行，因为疏水层析原理是高盐吸附低盐洗脱；如果是后者，则说明你的蛋白挂柱条件不合适。
  2，对于酶的纯化每一步跟踪的是比活性，单纯的活性意义不大。比如你说的都有活性，就很难取舍下一步操作用哪个fraction,对于用比活性来评价就容易取舍了，选比活高的就可以了。

• xingyi08 (2014-3-13 21:26:00)

  
  谢谢两位，再问一下，是不是酶活较大而相对酶活较低的样品就不用来进行下步层析了？也就是每次都要测定酶活和蛋白含量啦？酶活回收率可以接受的底线是多少

• skytree (2014-3-13 21:26:21)

  一个酶的纯化往往不是一步就能完成的，每一步纯化如何判断成功与否是要根据本部纯化的目的来定的。比如富集（capture）的纯化过程，追求的是酶活回收率，比活略
  有提高就行，就像HIC；要是精制（refine）的纯化过程一般追求比活的提高倍数，也就是纯化倍数，酶活回收率就是次要的了，当然高一点更好。
  一般用HIC做富集，酶活收率应该在50%左右就可以接受，至少30%以上，不然方法就有问题。每步都要就算酶活，蛋白量，比活，这样指导整个过程。