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【求助】IP拉下来的蛋白上面连的其他蛋白能不能洗掉？
【求助】IP拉下来的蛋白上面连的其他蛋白能不能洗掉？
请教园内高手：
用IP（免疫共沉淀）的方法拉下的蛋白上，通常都连有许多和他相互作用的其他蛋白，不知道有没有办法把这些杂蛋白洗脱下来，得到纯净的目的蛋白呢？
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-15 11:15 作者: qumm1985 来源: 分析测试百科网
最新回复
qumm1985 (2014-3-15 11:16:23)
caihong (2014-3-15 11:16:42)
IP是用来验证蛋白蛋白相互作用的，
要纯化蛋白，可以用亲和纯化的方法。
qumm1985 (2014-3-15 11:17:04)
QUOTE:
你说的没错，可是考虑到亲和纯化相对来讲麻烦很多，如果IP的蛋白能直接用于后续实验会更好。而且主要问题是我们的蛋白很大，GST-融合蛋白很难得到。我在文献上看到过用IP下来的蛋白洗两遍（用triton lysis buffer和kinase buffer）之后，拿去做Kinase assay。但是我不确定这样是不是真的能把别的蛋白洗下来……
66小飞侠 (2014-3-15 11:17:24)
ip拉下的蛋白都是因为蛋白间的一些相互作用被共沉淀下来的，可以加一些还原剂DTT或巯基乙醇消除S-S的作用，加一些去污剂如Triton X-100，加一些盐如NaCl，可以降低蛋白间的非特异相互作用！
qumm1985 (2014-3-15 11:17:53)
QUOTE:
这样啊，那是说在IP完成以后，加入这些试剂就可以解除与之相连的蛋白了吗？要是这样的话就太好了，不知你那里有没有具体加多少量到缓冲液里的信息呢？太感谢啦！
66小飞侠 (2014-3-15 11:18:26)
没有具体的数据，需要自己根据实验摸索，Triton2%，NaCl 0.5M以下，DTT 1mM，这几个数据是常用的，你试试，不行就调整，或者可以一次设几个浓度进行对照，找到最佳的组合！祝你好运！
qumm1985 (2014-3-15 11:18:52)
QUOTE:
我仔细看了那篇文献，它上面用来洗的buffer配方如下：25mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% TritonX 100, 10% glycerol, 5mM EDTA, 2mM dithioreitol, 25mM beta-glycerophosphate, 1mM sodium vanadate, 50mM sodium fluoride, 0.7ug/ml Pepstatin, protease inhibitor.
fox_79 (2014-3-15 11:19:56)
晕！不知道你怎么设计试验的，首先最大毛病在于，研究一个新的相互作用，为确定其真实性，通常会设计一个小实验，就是盐离子梯度washing的试验。一般体内天然的条件下，生理盐浓度相当于0.15M，所以在求证binding的真实性时，首先用D0.15、D0.3、(D0.4)、D0.5、(D0.6)、D0.8最高一般D1.0做一个梯度洗脱，检测在某一个浓度开始检测不到你的pro，也就是在这一盐浓度下binding会被破坏，常规越高表示结合越牢，则表示这种相互作用越可能是真实的。同时你会得到一个数据就是，在某个浓度开始出现binding大量减少，在某个浓度会彻底消失，这个数据对你未来的试验是非常非常重要的（就如同下象棋时下的闲子，看来不起眼没啥用，等到用到的时候你会发现多么重要）。
因此如果你有这样一个结果，就可以选择在最大损失前的那个浓度，或者彻底消失前的那个浓度，选取原则在于，最大损失之后的那些浓度你是否能够接受，就是你能不能收到足够量的kinase；另外一个原则是越高越好，一般来说D0.3的足够了，如果你可以更高更好，D0.6或者D1.0应该没什么非特异binding的能耐受这么高的盐离子。
至于Triton、DTT本来就应该在IP的buff.里面，所以这是废话。
qumm1985 (2014-3-15 11:20:21)
QUOTE:
小妹学习了。。。非常感谢你的指教！实在是新手，对这方面了解太少，还需要多多交流啊！
有几个问题还想请教一下您。你说的摸索梯度，是指两种蛋白共转染以后，Co-IP时的条件吗？盐浓度就是指NaCl吧。我们之前只用过两种，高盐和低盐。原来盐浓度对蛋白的结合这么重要啊！
“选取原则在于，最大损失之后的那些浓度你是否能够接受，就是你能不能收到足够量的kinase”，这句话是什么意思呢？是指盐浓度过高，抗体与Tag也无法结合了吗？
fox_79 (2014-3-15 11:20:45)
哦，不是的，其实很简单。当你做好了样品，快完成IP试验的时候，最后几步要用Washing buff.洗涤，对不？这个时候WBuf.的浓度是可变的，你可以选用一个浓度梯度进行（就是开始同时多IP几个样品，然后用不同管用不同浓度WBuf.洗涤Beads），洗涤的时候多上下颠倒1-2次，保证是不同WBuf.洗涤出来的样品，这样再用peptide或者别的elute的时候就可以保证确实是反映不同盐浓度条件下，两个蛋白相互作用的情况。
这个操作最大的难度在于，开始的时候几管样品的投入量要一致，加入Beads的体积要一致，但做习惯了其实还是很简单的。
这个实验可能存在的问题：就是你IP抓住的A蛋白也可能因为不同盐浓度从Beads上脱落，导致A蛋白本身呈现梯度下降，无法说明B蛋白的结合情况。但是这种现在一般出现在D0.5以上的浓度，所以可以通过曝光忽略（如果这个data你要发表的话，这其实是很好的data，专业的生化人士很喜欢的）。（我前面提过很少有蛋白能忍受D0.6，这是系统误差但属于可以忽略的部分）
盐浓度是指NaCl，Buff.是含有其他离子，但是通常主要成分是NaCl。
最后的问题：比如D0.3时结合量与生理差不多；D0.5时，A、B蛋白结合仅为一半；D0.6=1/4，D0.8相互作用消失，哪么这时候其实D0.3-0.6都可以选取，显然浓度越高越pure，但是问题是也许D0.5 IP下来的就不一定够你做kinase的了，这个看你自己决定；要么选择D0.3的，要么多做样品（做大量的样品）用高盐洗不计损失，后者工作量较大，但是确实更为可信。这和你文章将要发表的级别也有关系
66小飞侠 (2014-3-15 11:21:09)
QUOTE:
我们实验室原来好像都没有考虑过洗脱时的盐浓度问题，只变化过裂解液的盐浓度。恩，我知道了，我做几个梯度试试看！再问您个问题行吗？那个裂解液的盐浓度需要控制吗？是不是和洗脱液的道理是一样的呢？非常感动你耐心的解答～
fox_79 (2014-3-15 11:21:32)
Lysis Buff.的浓度不需要控制的，你可以用同一个浓度裂解用不同浓度WBuf.漂洗。当然如果你想用不同浓度的Lysis Buff.裂解也没错，但是对于这个试验你增加了一个难度，就是你要保证你初始的各管中cell一样，不然总蛋白都不同，哪么A蛋白也可能就成了变量。
所以我提醒你在Washing的时候，多上下颠倒1-2次（或者漂洗次数增加1-2次），就是为了逼近盐浓度对Binding影响的事实。这个试验最佳的方案是初始Lysis Buff.浓度不同，但是要求太高太高了
顺便告诉你一个skill，如果你裂解的时候用高盐，再用相同WBuf.，A蛋白从Beads上非正常脱落会减少这个可以在你最后的目的试验中使用，等于增加了kinase的产率，但是你的预试验要差不多准确哦，不然也可能什么都没有了。
小野花 (2014-3-15 11:21:50)
……
真学习了 我们一直是Lysis Buffer和Washing Buffer一样的离子浓度 还真没考虑过洗脱的问题
【求助】IP拉下来的蛋白上面连的其他蛋白能不能洗掉？