【求助】包含体裂解纯化的困惑

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• vivian4123 (2014-3-15 17:14:29)

  
  我现在做的是用PQE30表达菌株表达的一个重组蛋白。原核表达出大量包含体。我用以下步骤进行了包含体的纯化，但是包含体仍然在沉淀中，实验失败。
  1.10000g离心1分钟收集诱导表达的菌体
  2.溶菌酶（4mg/ml）37度30分钟裂解
  3.冰上超声破菌：击7秒，停5秒，400w，30分钟
  4.15000g离心30分钟，弃上清，取沉淀
  5.沉淀用含Triton-100的洗液洗一次，冰上30分钟
  6.15000g离心30分钟，弃上清，取沉淀
  7.沉淀用8M尿素溶液（含DTT10mM,巯基乙醇0.1％）重悬，4度过夜
  8.15000g离心30分钟，取上清。上清与沉淀分别SDS-PAGE，发现目的蛋白仍在沉淀中。也就是说包含体没有裂解。不知道哪里做的不对，希望有经验的朋友能给点建议。

• yonger (2014-3-15 17:14:54)

  
  我也碰到类似的问题，8M尿素并不能很好溶解我的包涵体蛋白，我打算试一试6M盐酸胍。另外，尿素溶解并不可能是百分之百的，总会有部分的不溶蛋白。而且我用的溶解温度都是在室温进行的，没有比较过室温和4度的效果有什么区别。我也在改进条件，但愿经验能对你的蛋白有用。

• 04906 (2014-3-15 17:15:23)

  
  我们实验室做过许多包含体溶解,都是用8M尿素溶解的,一般都能够溶解开.你的包含体没有溶解开,可能和以下因素有关:
  1.破菌不完全.
  核酸没有完全打碎.如果破菌液比较粘稠,且离心后沉淀不够实,那么就是破菌不够,核酸没有完全打断,这可能造成核酸和蛋白结合,因此会较难溶解.
  为了确保破菌完全,建议你离心前,取菌液镜检.如果镜检时,大部分已经破开,且用玻棒挑起破菌液时无丝状物,则破菌已经完全,可以离心.否则要继续破菌.
  2.包含体洗涤不够干净.
  如果包含体洗涤不干净,残留的细胞碎片,脂类等物质也会造成包含体溶解不清亮.因此,建议你增加洗涤步骤.可以在Triton-100洗涤后加一步洗涤(2M尿素+50mM Tris+5mM EDTA),然后再用20mM PB+0.5M Nacl+50%乙醇洗涤．我不知道你纯化时是否要用到离子柱，如果要用，则最后一步一定要洗涤，否则很可能挂不上柱子．
  ３.溶解比例太小．
  　　溶解比例太小也可能造成溶解较少．我们一般溶解比例是１克包含体（湿重）用５到１０毫升的尿素来溶．另外，溶解时可以加热到４０度左右，温浴半小时．
  　你可以按上述建议试一下，应该可以溶解

• vivian4123 (2014-3-15 17:15:52)

  
  谢谢大家的建议了。我的蛋白是打算要过柱纯化的。看来必须需要20mM PB+0.5M Nacl+50%乙醇洗涤了。这个PB是什么，是PBS吗？
  另外我液打算要用盐酸胍裂解了，但是我老板说用异硫氰酸胍也可以，是这样的吗？这么用法？怎么没看到有人这样用的呢？

• 831226 (2014-3-15 17:16:23)

  
  PB与PBS 是不一样的，PBS中加入NaCl，而PB 中没有。你可以洗涤，但是不一定洗涤后就能够溶解的，有部分蛋白即使你除了核酸和膜蛋白等杂质也不溶，你可以试试不加缓冲系统，用纯水加尿素溶解。我做过这样的效果不错。
  我跟人认为尽量不要用盐酸胍溶解，分离时很难初净。

• 00无名指00 (2014-3-15 17:16:50)

  
  回复：“7.沉淀用8M尿素溶液（含DTT10mM,巯基乙醇0.1％）重悬，4度过夜”。
  尿素在低温下析出了，而你的蛋白也同时再沉淀了，有尿素的时候为什么要4度过夜呢？室温或更高一点的温度试试。

• redbutterfly (2014-3-15 17:20:58)

  另外，溶解时可以加热到４０度左右，温浴半小时．
  　你可以按上述建议试一下，应该可以溶解
  
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  加热溶解会不会导致尿素的分解呢？

• vivian4123 (2014-3-15 17:22:05)

  谢谢大家。我再优化一下条件试一下。有结果再来汇报。

• vivian4123 (2014-3-15 17:22:42)

  
  我又重新实验了。用纯水溶解的8M尿素，37度溶解包含体1小时，然后室温过夜。发现包含体还是只有很少部分溶解了。SDS-PAGE结果为蛋白仍然大部分在沉淀中。同时还用6M盐酸胍溶解包含体，也是37度1小时，然后室温过夜，同样是蛋白大部分在沉淀中。
  怎么办？我是要进一步镍柱纯化的，我实在是不知道该怎么办了！！！

• vivian4123 (2014-3-15 17:23:00)

  
  我又刚刚用软件分析了一下我的目的蛋白，发现该目的蛋白是疏水性：－0.44，等电点是5.19。是不是说我的蛋白是疏水性蛋白呢？也就是说不是很容易在水中溶解呢？那么有没有可能是8M尿素溶解包含体实际是已经将包含体溶解了，而蛋白因为不溶于水，所以沉淀下来了？不知道我这种想法是不是对的？有高手给解释一下吗？

• DONT (2014-3-15 17:23:35)

  你需要摇，或vortex，或用匀浆器，总之是促进溶解啊，
  不是只放到37度或室温就能溶解啊

• DONT (2014-3-15 17:24:31)

  
  你上面的想法肯定是不对的