【求助】菌体在表达目的蛋白时出现＂双眼皮＂

最新回复

• hustwb (2014-3-16 23:15:36)

  如果蛋白有His6 tag，那就是常见情况
  不用担心

• pengke1983 (2014-3-16 23:16:57)

  可是我的蛋白没有His tag，我的另一种蛋白和这个蛋白仅有两个氨基酸的差异就没有这种情况出现，纯化效果非常好，有人分析说是蛋白质的异构体，我不太明白，所以想进一步请教！

• yapuyapu (2014-3-16 23:17:26)

  
  有两种可能：
  １.你的蛋白质比较脆弱易断，在处理和柱过程中段了．这种可能性比较小，除非是你的蛋白很脆弱．我们以前做的时候遇到过这种情况．不管用什么柱子都除不掉．到最后才弄明白两条带有一条是目的蛋白的断裂后形成的
  ２.确实有异构体．我们跑电泳时，用ＳＤＳ的目的有两个：一个是使蛋白带负电，消除原蛋白带的电贺差异，另一个目的是使蛋白质成棒状，消除蛋白质的形状影响．这样经过ＳＤＳ处理后，走电泳时蛋白质就会只有分子量的影响了．
  　　但是，如果蛋白质有二硫键，走非还原电泳时，因为不加巯基乙醇，只加ＳＤＳ就不能完全使蛋白质成棒状，走电泳时还会有形状的影响．造成走非还原电泳时，虽然分子量相同，但在电泳上是两个相近的条带．
  为了验证是不是有异构体，可以用同一样品分别走还原和非还原电泳，如果还原电泳是一条带，非还原电泳是两条带，那就是有异构体．

• 小螺号 (2014-3-16 23:17:57)

  有histag为什么会出现这种情况？是因为六个组氨酸裂解掉了吗？谢谢！

• xiaoxiaoniao (2014-3-16 23:18:25)

  
  纯化中可能出现降解
  所有操作尽量低温，减少操作步骤，如果不能避免那就没办法了
  一些蛋白纯化中的降解很难控制，只能是减少降解，不能完全阻止降解，祝好运哦

• pengke1983 (2014-3-16 23:18:58)

  我做过电泳了，菌体电泳，包涵体电泳，以及后续的纯化过柱后的样品电泳都是还原，非还原对比跑的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，就像您说的那样，非还原电泳是两条带，还原电泳是一条带，那出现这种情况该怎么解决呢？如何使其在表达的时候就不形成异构体呢？恳请赐教！

• ALALA (2014-3-16 23:19:21)

  
  （1）蛋白质好像没有异构体这一概念，所以LZ不用担心异构体的问题，而且单纯的构象变化在普通的SDS-PAGE上是反映不出来的，想看蛋白质构象的不同Native-PAGE是必须的。
  （2）LZ遇到的问题有点麻烦，一般一道这样的问题首先考虑的是蛋白质降解的问题，可以在操作时采用低温、加蛋白酶抑制剂的方法，但是LZ在帖子中提到一句：菌体跑电泳就是两条带，这说明在发酵的过程中就已经形成这样的问题了。后期的分离纯化很难避免这样的情况出现。
  （3）还原电泳一条带，非还原电泳量条带是由于二硫键的问题，非还原电泳上形成的是蛋白dimer，这个在纯化是注意是可以减轻或者避免的。
  （4）我以前在蛋白纯化时也出现过这样的情况，但是全菌蛋白电泳上是很明显的一条带，这种降解是由于后期的纯化的缘故，LZ全菌蛋白就两条带，而且与另一个蛋白只有两个氨基酸的差异，而另一个就不存在这样的问题，这样的问题就很奇怪了，难道是表达时就存在切除一个肽段的可能？
  （5）原核表达时首位的Met有时被切掉有时却会保留下来，这个问题不知LZ考虑了没有，但是仅仅一个氨基酸的差异在PAGE上的差别是很小的，会不会导致“双眼皮”我也不知道，但LZ可以分析一下。

• pengke1983 (2014-3-16 23:20:12)

  我考虑过Ｍet的问题，但它的分子量只有１００多，不太可能形成明显的两条带，您说的这一点很对：（3）还原电泳一条带，非还原电泳量条带是由于二硫键的问题，非还原电泳上形成的是蛋白dimer，这个在纯化是注意是可以减轻或者避免的。我的分子中有四个半胱氨酸，正常折叠情况下形成两对二硫键，我的包涵体表达量很高，远远大于菌体蛋白的３０％以上，能不能因为表达的速度和量过高，错误折叠的机率就更大？可是经过变复性它仍恢复至错误折叠，且错误折叠与正确折叠的比率几乎没变就有些奇怪了，我想试试在变性时加些ＤＴＴ，复性时加点ＧＳＳＧ，看能否有所帮助，但手头上没有ＧＳＳＧ，不知道靠复性稀释的方法能不能达到同样的氧化目的．

• zwsyrt (2014-3-16 23:20:51)

  
  这种现象的确经常存在。
  我也遇到过。
  我的那个蛋白分析原因应该是被一种特异性的酶所特异性讲解的。识别的部位应该是特殊的序列。我猜你的可能也是。
  而且，你可以将纯化后的你的蛋白在室温下放置不同的时间，分别取样，一般来说，如果是这种特异性降解，会出现一个条带逐渐变成另个条带。你可以看看你的是不是这样。
  如果是这样，建议你在提纯过程中，加入蛋白酶抑制剂和EDTA。

• mod=8048 (2014-3-16 23:21:15)

  借楼主的贴，说两句His-tagged protein 出双眼皮的问题
  经常出现在以包涵体表达的His-tagged protein用尿素或盐酸胍变复性的sds-page中
  有很多的文章中都可以看到类似情况
  真正原因不清楚，个人认为应该是蛋白变性或复性不完全造成的
  理论上是应该可以避免的，实际上很难
  具体原因肯定和his tag的存在有关，但应该不是断裂造成的
  6个his还不到1kd，应该不会造成明显分开的2条带