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【求助】蛋白纯化求教
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本人最近在做蛋白纯化,使用的是MACHEREY-NAGEL公司的Protino Ni-TED2000 的柱子，该柱子是已经填好了的，直接平衡一下过柱即可。但是目前纯化下来，存在一些问题：
1、我所表达的蛋白存在于包涵体内，根据说明书指导，我们用8M尿素的LEW(Lysis-Equilibration-Wash buffer)将包涵体破碎开来，离心取上清，但过柱纯化后跑电泳发现蛋白并未结合到柱子上，不知原因是什么）：有用过该公司柱子做过蛋白纯化的战友能否指点一二？？
2、说明书上写，BUFFER的PH不要大于8.4,否则会将柱子里的二氧化硅溶解.我们按照说明书上的配方,蛋白如果在包涵体内,则用Denaturing Solubilization buffer处理(含50mM NaH2PO4;300mM NaCl;8M urea;最终将PH调至8.0),上柱,最后将柱子中结合的蛋白溶下来则采用Denaturing Elution buffer(50mM NaH2PO4;300mM NaCl;8M urea;250mM imidazole;最终将PH调至8.0),现在的问题是,按照该配方纯化下来的蛋白跑电泳什么都没有,过柱的滤液电泳下来倒是有蛋白的，而且很浓,这样看来柱子似乎根本没有起到结合作用.我们现在非常着急,等着这个蛋白纯化好了做下一步实验,有用这个柱子做过蛋白纯化的战友,能否帮忙解答一下呢??谢谢了!!
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最新回复
lorri (2014-3-16 23:41:53)
你的上样没有还原好。
你用 10 mM 的DTT 处理一下样品，然后再上样，洗脱的时候可以用低PH buffer洗脱。5左右就可以了。祝你好运。如果还有什么问题可以联系我。
fqswdzd (2014-3-16 23:42:21)
Problems with vector construction
• Ensure that protein and tag are in frame
Incorrect binding conditions
• Check composition of buffers and verify pH 7-8. Ensure
that there is no chelating or strong reducing reagent or
imidazole present
use gravity flow to strengthen the binding effect
utt0989 (2014-3-16 23:43:16)
另外,我重新配置的Denaturing Solubilization buffer\Denaturing Elution buffer,方法与前一次的一样,只是上次是放置了一天后再用来纯化的，这次是现配现用的.而说明书上写的是"Due tu the dissociation of urea,prepare buffers immediately prior to use."尿素分解这么快吗?配好了放置一天效果都那么差吗?
fqswdzd (2014-3-16 23:43:45)
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不会吧，我们经常用urea ,也没有发现这种问题啊。倒是看到过放时间长了会产生C=N的说法。
ero11 (2014-3-16 23:44:35)
至于尿素配制一天后会降解，在高温下是存在的，但在室温以下（特别是在冷藏条件下）放置时间长一些是可以使用的，我就经常放置（4-10℃）一周使用，并没有发现明显差异，当然也要视具体情况而定。
HP007 (2014-3-16 23:45:12)
NI-teD是所有镍填料中作用力最弱的一种,如果不能换填料又在变性条件下做,那建议用盐酸胍变性代替尿素,这样也许效果更好.有不少用尿素挂不上而用盐酸胍能挂上的例子,原因在于盐酸胍能把尿素打不开的结构打开,标签暴露更充分,吸附效果更好.
utt0989 (2014-3-16 23:45:39)
QUOTE:
那请问用盐酸胍代替尿素的话,该用多大浓度呢?有没有具体的配方?我想试一试,谢谢!!HP007 (2014-3-16 23:46:25)
nn255 (2014-3-16 23:47:08)
你用 10 mM 的DTT 处理一下样品，然后再上样，洗脱的时候可以用低PH buffer洗脱。5左右就可以了。祝你好运。如果还有什么问题可以联系我。
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用GuHCl效果肯定要好一些；
楼上的建议不可行，Ni柱buffer不能含有DTT
包涵体的纯化，您不必要按照他的protocol。当你使用了lysis buffer后，这时提取的是全蛋白，蛋白种类非常多。而如果你用超声或者french press破碎细胞，然后低速离心收集包涵体，弃上清，那么膜蛋白和可溶性蛋白都在上清里被你扔了，这时你再充分洗涤（可以用buffer以及 含detergent，比如triton的buffer），再离心收集包涵体，此时就可以得到很高的纯度（洗涤的步骤可以长一点，我一般2*1小时）。然后你再用Ni柱纯化，应该可以得到很纯的蛋白。
个人经验，强烈建议。
zhihui小新 (2014-3-16 23:47:58)
谢谢各位热心战友的帮助!!我又重新换了一个柱子,纯化下来跑SDS-PAGE条带很浓,测蛋白浓度有1.1毫克每毫升.
后来我对比了一下,MACHEREY-NAGEL公司的Protino Ni-TED2000 的柱子,对于纯化包涵体的溶液,其中Denaturing Solubilization buffer里面不含有咪唑,只有Denaturing Elution buffer里面含有咪唑;而新的柱子所用的溶液里面,Binding Buffer中含有低浓度的咪唑,Elution Buffer中含有高浓度的咪唑,据说是低浓度的咪唑有利于蛋白挂柱,高浓度的咪唑有利于洗脱.
#问号# (2014-3-16 23:48:32)
跨膜蛋白是不是很容易产生包涵体，如果用真核表达会不会出现呢？
小野花 (2014-3-16 23:49:09)
请教一下，低速离心收集包涵体时用的离心力是多大呢？我用的13000RPM,2000RCF对超声后的体系进行离心，发觉沉淀中的包涵体蛋白仍然很不纯，与诱导后的菌体相比，条带差异不大。会不会是离心力太大的原因呢？
另，用尿素溶解蛋白时的条件该怎么掌握呢？温度、时间、是否需要振摇呢？
......
nn255 (2014-3-16 23:49:34)
另，用尿素溶解蛋白时的条件该怎么掌握呢？温度、时间、是否需要振摇呢？
Re: 低速离心收集包涵体，我用9，000g ，10 min
我用的13000RPM,2000RCF对超声后的体系进行离心，发觉沉淀中的包涵体蛋白仍然很不纯，与诱导后的菌体相比，条带差异不大。
Re: 我猜你用的是20，000 g？ 至少可溶性蛋白已经被去掉了。当然如果你在EP管里离心，不洗涤的话，自然会有一部分可溶蛋白存在残余的上清里。20，000g，膜蛋白也应该是在上清里。所以如果你还是有很多条带的话，我怀疑细胞没有破碎充分。
用尿素溶解蛋白时的条件该怎么掌握呢？温度、时间、是否需要振摇呢？
Re：看你下游的目的。如果只是纯化，37度都可以的，溶得快一点。温度低容易析出沉淀。如果做复性，最好用高纯度尿素，我知道有的实验室先把尿素纯化一次再用。
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