【求助】镍柱纯化为何总存在杂带，20mM咪唑洗脱...

最新回复

• caihong (2014-3-17 15:31:57)

  
  Ni柱纯化本来就不能获得很纯的蛋白啊。要想得到纯度很高的应该再过别的柱子或者什么的才行啊。不用担心吧。你的蛋白不需要很纯的话其实过Ni柱就可以了。你也可以过两次柱子试试。

• flower-201 (2014-3-17 15:32:15)

  关键就是在于你选择不同浓度的咪唑进行分布洗脱，然后你才能在这个预实验中摸索到合适的洗脱条件，才能放大来洗脱目的蛋白。

• greenbee (2014-3-17 15:33:35)

  
  光是ni柱纯化是不能得到很纯的蛋白的，除非你是包涵体，上清太杂了，你想所有蛋白质都含有组氨酸的阿，只是相邻数目的区别而已。

• ritou1985 (2014-3-17 15:33:51)

  呵呵，如果是包涵体，过ni柱后基本会是一条带。包涵体已经比较纯了。

• 04906 (2014-3-17 15:34:14)

  
  非常感谢几位对我镍柱纯化问题的回复，我现在克隆表达了两个蛋白，其中一个蛋白有一条非目的带，算是让人高兴的了，另外一个表达蛋白有四条杂带（有二条还染色很深），杂带都在目的带下面，不知是否是存在亚基的情况；怎样才能判断存在亚基现象；另外我尝试用不同浓度的咪唑洗脱时，对目的带洗脱倒是很明显，依旧不能完全去除杂带

• 04906 (2014-3-17 15:35:03)

  
  非常感谢几位对镍柱纯化蛋白的回复，我看到杂志上登的镍柱纯化蛋白带照片都很单一，所以我一直以为这种方法得到的蛋白是很纯的，看来并非如此

• gogo (2014-3-17 15:36:23)

  
  就镍柱纯化标签蛋白,好多公司的protocol中有很详细的说明,我这简单的说几个可优化纯度的方法,就我而言,提高纯度,首先要优化表达条件,尽量获得更多比例的可融性蛋白,同时又要确保蛋白的完整性.
  1.表达诱导条件可温和点,30度等
  2. 超声条件可优化,宁可保证质,而放弃量.
  3. Binding中可加入适量的imidzaole来降低柱子的非特异性吸附,从而在蛋白纯化初期就降低杂蛋白的吸附.
  4.洗涤条件可更加苛刻,这个需要优化imidazole的浓度,盐浓度,甚至可加入适量的去污剂或甘油等降低蛋白间的非特异性吸附,从而提高蛋白纯度.
  祝实验顺利!

• abc816 (2014-3-17 15:36:41)

  
  楼主不妨考虑再过一个分子筛

• xyw5 (2014-3-17 15:36:57)

  
  纯化的关键在于样品本身和纯化的条件,如果表达中有降解或不完全,破碎导致断裂,这样带标签的部分自然难和目标蛋白很好分离,如果不是这样的原因,那纯化需要留意的是只用20mM很难把一些杂带去掉,大多说明书那样一到切的方法不会有好效果的，除非运气很好的情况下．最好是用20，50,100,300-400mM咪唑做阶段洗脱，找合适的浓度洗杂带和目标蛋白，并非镍柱子不能得到纯的蛋白，我们做过不少，包括我们的客户，大多都得到不错的结果．建议别去过太多的柱子，那样未必有好的效果，除非没办法，优先还是优化镍柱子的洗脱条件，相信会有不一样的效果．

• jujuba (2014-3-17 15:37:39)

  建议楼主透析后第二次过柱，甚至可以第三次，有时在第二次可以达95%以上。

• utt0989 (2014-3-17 15:37:56)

  
  楼主20mM咪唑洗脱浓度有点低吧，我们都是用几百mM的咪唑洗脱。另外，在binding buffer和wash buffer中也可以添加咪唑，20－40mM，有利于减少非目的蛋白的吸附。

• 喵咪 (2014-3-17 15:38:15)

  
  Two step process:
  First, determine the wash condition by running linear gradient imidazole, 0-400 mM, run gel to see where your target protein and inpurity is in, usually, target protein locate high conentration part or later fraction of elution.
  Then, add wash step which decided by your precious gradient elution, for instance, 50 mM imidazole wash for 5 cloumn volume, then elute your target protein by run higher imidazole.
  Try and see what happen.

• xiaoxiaoniao (2014-3-17 15:38:40)

  楼主20mM咪唑洗脱浓度有点低吧，我们都是用几百mM的咪唑洗脱。另外，在binding buffer和wash buffer中也可以添加咪唑，20－40mM，有利于减少非目的蛋白的吸附。
  
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  20mM是用来washing的，最后再用500uM的浓度elution。