【求助】关于疏水层析

最新回复

• yes4 (2014-3-17 16:53:06)

  
  建议你将硫酸铵换成氯化钠试试看，一些疏水性强的蛋白在高浓度的硫酸铵中容易沉淀。

• jkobn (2014-3-17 16:55:52)

  
  建议你将硫酸铵换成氯化钠试试看，一些疏水性强的蛋白在高浓度的硫酸铵中容易沉淀。

• Ao7 (2014-3-17 16:56:09)

  硫酸铵盐析作用比较强。

• tianmei001 (2014-3-17 16:56:57)

  
  洗脱的柱体积不到吧？梯度走了，再走2~3个柱体积看看。

• guagua (2014-3-17 16:57:13)

  你可以看看梯度洗脱时含硫酸铵溶液和不含硫酸铵溶液的pH是否一致，我感觉这个有可能是pH改变造成的。梯度洗脱时如果pH改变不仅有盐析作用，等电点沉淀作用也会出现，这时蛋白可能就会沉淀在填料上，如果继续用不含硫酸铵的溶液洗脱，多洗脱几个柱体积，等pH改到远离pI时可能就会洗脱了。
  如果不是pH的原因可以用NaCl体系、摸索其他pH条件下的挂柱洗脱条件或者更换填料（Phenyl 、Butyl）等。

• orangecake (2014-3-17 16:57:30)

  
  我真的要疯了！！
  参考了以上各位的意见再做了试验 梯度洗脱时含硫酸铵溶液和不含硫酸铵溶液的pH
  调为一致（不含硫酸铵的PB buffer PH是7.0 加入硫酸铵后略偏酸 所以用Tris调成一
  致）
  今天的实验是这样的 因为之前我试验过阶段洗脱 所以用0.2M的硫酸铵先直接洗
  洗下的蛋白没有酶活 然后我就采用梯度了 从0.2M--0M硫酸铵 一共500ml 结果依然
  是什么也没洗下来 接下来我又用不含硫酸铵的buffer洗 洗下来一些蛋白 但是没有
  酶活 最后干脆直接拿蒸馏水洗 终于才有我的酶下来了
  我用的是苯基填料 平衡柱子用的20 %硫酸铵的buffer

• bamboo16 (2014-3-17 16:57:52)

  不知道你最后用水洗后最终的得率如何？
  通常我在用疏水柱时，最后用水洗是最为柱子清洗作用的，这部分的蛋白大多已经失活，不知楼主这部得到的酶活性如何？
  必须用水才能洗脱，说明目的蛋白与填料结合太牢固。可以换成疏水性稍弱的填料，或者降低上样buffer的硫酸铵浓度，或用其它盐。
  pH好像对疏水作用影响不大，除非因接近pI影响蛋白的溶解度。

• 831226 (2014-3-17 16:59:19)

  
  首先我观察到水洗下来的液体不是透亮的 好像有点偏乳白 酶活性还有 我只是肯定还有 还没确定是否有损失

• 831226 (2014-3-17 17:00:11)

  乳白色是否是沉淀？
  估算一下比活，如果比活没有明显提高或者下降，同时蛋白纯度又有提高，说明有失活现象。

• wmp1234 (2014-3-17 17:00:28)

  我们也遇到过相似的问题，用水才能洗脱下来，用别的方法，如乙二醇，也不能有很好的效果。建议可用乙二醇再试试，不行就换别的层析住。

• vcve (2014-3-17 17:00:45)

  觉得你的蛋白疏水性太强了 ，建议换苯基（低取代）、辛基或丁基填料试试。

• orangecake (2014-3-17 17:01:08)

  QUOTE:

  原帖由 vcve 于 2014-3-17 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  觉得你的蛋白疏水性太强了 ，建议换苯基（低取代）、辛基或丁基填料试试。

  我用的就是苯基的填料 准备要用乙二醇试一试了 从来没试过 所以再请教一下大家 我的起始硫酸铵浓度是20% 洗脱的时候先用0.2M的硫酸铵直接洗 能洗下来很多杂蛋白 接下来我就想用0.2---0M的梯度 所以请问这个时候 我需要在梯度混合槽的左边和右边液体中都加入相同浓度的乙二醇吗 并且乙二醇的终浓度应该是多少比较合适

• youyou99 (2014-3-17 17:01:27)

  苯基柱有high sub，low sub，HP三种，每种填料的疏水强弱也各不相同。如果你选用的是low sub时出现上述情况，建议改用butyl。