【求助】western 没有目的带，gadph清楚

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-17 17:02 作者: 68943512yao 来源: 分析测试百科网

刚开始做western，稳态转染细胞，经电生理测定由功能蛋白出现，细胞全蛋白，分子量是155/135kd，上样量从50-150ug/lane。8%sdspage电泳，100v200ma湿转5小时，丽春红有目的位有条带出现，5%脱脂奶粉tbs稀释，封闭1h，37度，摇床。alomone一抗，1：200tbs稀释，4度过夜，tbs洗膜5min*4次，rockland二抗1：2000稀释，oddsay红外线显影。或加辣根过氧化物酶标记二抗，dab显色，gadph都没问题，就是没有目的条带。同期做其它蛋白，同样二抗，有条带。用该一抗去做细胞的共聚焦，也可以看到通道蛋白分布。
各位，我的问题可能出在哪？

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【求助】western 没有目的带，gadph清楚

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fox_79 (2014-3-17 17:02:48)

不知你的目的蛋白表达是否丰富？上样量到了150微克应该没有问题吧？
既然转膜后有目的蛋白的条带出现，GADPH也能做出来，说明你的2抗和标本都是ok的。问题可能出现在的detection上面，为什么没有选择ECL发光显色呢？DAB显色好像灵敏度比不上ECL,而且据说有的杂志不接受其做出来的bands。
另外提醒你一个容易出错的问题：一抗和二抗搭配吗？一抗是什么来源？二抗是抗羊还是抗兔？比如说一抗是兔来源的，2抗应该选择羊抗兔或者鼠抗兔。
68943512yao (2014-3-17 17:03:11)

首先，谢谢你。因为电生理已经检测到了，几乎每个细胞都存在herg电流，蛋白表达应该没问题，一抗是抗兔的，二抗选的是匹配的。
fox_79 (2014-3-17 17:03:31)

我曾经做过herg的western ,我的条件是10%sdspage电泳，70v湿转3小时，有冰浴。5%脱脂奶粉pbs稀释，4摄氏度封闭过夜，santa一抗，1：200tbs稀释，室温2小时，tbs洗膜15min*3次，rockland二抗1：4000稀释，oddsay红外线显影。仅供参考。
68943512yao (2014-3-17 17:04:01)

QUOTE:
原帖由 fox_79 于 2014-3-17 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我曾经做过herg的western ,我的条件是10%sdspage电泳，70v湿转3小时，有冰浴。5%脱脂奶粉pbs稀释，4摄氏度封闭过夜，santa一抗，1：200tbs稀释，室温2小时，tbs洗膜15min*3次，rockland二抗1：4000稀释，oddsay红外线显影。仅供参考。 ...

我现在觉得可能蛋白还是不够，因为我使用ripa提的转染细胞全蛋白，楼上的同仁是怎么做的呢？还有我倒是最后还想让我豚鼠心肌做，不知道你使用什么做的呢？
eve_49 (2014-3-17 17:04:18)

会不会是转膜的问题，如果是湿转的话，我们用INVITROGEN的预制胶做的，用15v2h效果还可以（目的蛋白170kd），大分子量的蛋白一般很少用这么高的电压转的（湿转常用恒压，半干转常用恒流），对于大分子量和小分子量的蛋白转膜都是很困难的，我前段时间转26kd的蛋白，湿转100v1h转膜的效率还不到50%，所以有时候条件还是要优化的
68943512yao (2014-3-17 17:04:38)

还是没有带子，每次染胶，感觉目的位有带子，转完用丽春红染就看不到带子，难道是没转过去？
我觉得一是蛋白问题，二是转膜问题，三是抗体问题。
都怎么检测呢
想借你们的抗体试一下。
请pm联系
junjie05 (2014-3-17 17:04:53)

我觉得是转膜问题的可能不大，是否电泳用的是预染marker,如果相应大小的marker都转过来了，那不应该是转膜问题。你的目的蛋白的一抗是否是多抗，浓度是否合适，抗体是否事先实验过是否可用，实验中是否设计了阳性对照？一抗是多抗的要比单抗的效果好，抗体浓度太低也不容易杂出带，是否确定这个细胞系有可以用western的检测的数量级的这个蛋白的表达呢？
KGZ564 (2014-3-17 17:05:12)

我遇到同样的问题，阳性对照有，内参有，目的蛋白无。
考虑1蛋白量少。
2转膜摸个梯度，
3一抗浓度低。
4一抗二抗比例不合适。
windy+++ (2014-3-17 17:05:35)

会不会是转膜的问题，如果是湿转的话，我们用INVITROGEN的预制胶做的，用15v2h效果还可以（目的蛋白170kd），大分子量的蛋白一般很少用这么高的电压转的（湿转常用恒压，半干转常用恒流），对于大分子量和小分子量的蛋白转膜都是很困难的，我前段时间转26kd的蛋白，湿转100v1h转膜的效率还不到50%，所以有时候条件还是要优化的

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为何“湿转常用恒压，半干转常用恒流”?
15V 2h转170kd分子量？我一般都要100V 2h才行. 有这么大的差别？
redbutterfly (2014-3-17 17:06:00)

QUOTE:
原帖由 windy+++ 于 2014-3-17 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
会不会是转膜的问题，如果是湿转的话，我们用INVITROGEN的预制胶做的，用15v2h效果还可以（目的蛋白170kd），大分子量的蛋白一般很少用这么高的电压转的（湿转常用恒压，半干转常用恒流），对于大分子量和小分子量的蛋白转膜都是很困难的 ...
同问。
我用的200mA恒流转膜50min，94KD的基本全部转上，丽春红染色显示，普通marker7条带都在。转过膜的胶考染后，看不到任何条带。
没做过再大的蛋白了。
我用的biorad的湿转。PVDF膜＆NC膜都试过。都是这个条件，转膜结果都不错。
68943512yao (2014-3-17 17:06:22)

一抗和二抗得比例有多大的关系?
68943512yao (2014-3-17 17:06:38)

我已经做出来了。原因是一抗的问题，所以，有时也要怀疑一下公司产品。
one (2014-3-17 17:06:55)

请问楼主,用哪个公司的抗体做出来的?
68943512yao (2014-3-17 17:07:17)

QUOTE:
原帖由 one 于 2014-3-17 17:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

请问楼主,用哪个公司的抗体做出来的?
chemicon的一抗，做的是全蛋白