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【求助】pet-15b原核表达

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-17 17:25    作者: applebook=213    来源: 分析测试百科网

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【求助】pet-15b原核表达

最近15b原核表达总是出问题，很郁闷阿。
原来表达出来的质粒
刚开始是不张，后来是张起来，但诱导后没有活性。粗提质粒没有丢失。
分别在BL21（DE3）和BL21（DE3）plyS都进行了表达。
请教各位表达高手。
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最新回复

  • utt0989 (2014-3-17 17:26:15)

    如果你确定基因序列没有突变的话,可以提取质粒重新转化一次,然后在诱导表达,或者换一株BL21宿主菌,防止宿主菌本身发生突变.仅供参考

  • applebook=213 (2014-3-17 17:26:44)

    已经试过了
    重新提了质粒，买了BL21（DE3）plyS感受态，做了转化。比BL21（DE3）要好一些。菌能摇起来，加过诱导剂后，诱导3－4小时没有问题。时间在长一些，就死了，菌体清亮。有人说是噬菌体污染，可是我认为不太像。要是污染，估计菌体不会生长时间那么长吧？即使3－4小时菌体裂解之前收菌，放置一段时间后也裂解了。
    请高人指教，谢谢

  • duoduo (2014-3-17 17:27:12)


    是不是蛋白有毒性啊

  • applebook=213 (2014-3-17 17:27:31)


    问题还没有解决，烦啊
    明明只是一个很简单的表达实验，却总是菌体无缘无故死亡？原以为过了节，质粒重新酶切验证后就应该没有什么问题了，可是昨天作的转化，刚刚看到平皿的菌体也有没张起来，而且形态不规则。又出现了新的问题：原来只是液体培养基摇不起来，现在固体也出现这个问题了。
    到底怎么办啊？

  • cj_mondy (2014-3-17 17:28:32)

    根据你说的很可能是你的蛋白有本地水平表达从而表到处毒性蛋白以至于不长斑，或是摇稀，其实pLysS 宿主菌也能产生低量 T7 溶菌酶，所以也许你蛋白毒性大所以些许就可以致死，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，能够是最严紧控制T7 的启动，所以我看你是否可以用pLysE试试。

  • 831226 (2014-3-17 17:28:56)

    相关疾病：
    感染
    就是被噬菌体感染了吧，换一下抗噬菌体的感受态就没问题了

  • applebook=213 (2014-3-17 17:29:14)

    谢谢大家回复
    自己也觉得是噬菌体污染。现在对PET-15b转化的菌体也会死亡，所以不太像蛋白有毒性。
    将所有的菌扔掉后，只留质粒后仍有出现问题。
    什么感受态抗噬菌体呢？
    已用了BL21(DE3),BL21(DE3)PlyS,Rossette,都不行啊
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