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【求助】用抗血清来做western blot的一抗有意义吗？
大家好，许多资料显示都是：把表达的目的蛋白纯化后免疫兔子，然后收集血清（多抗）再与表达的目的蛋白作western blot，用购买的二抗标记显色。【求助】用抗血清来做western blot的一抗有意义吗？
我想：这有意义吗？用自己的蛋白免疫兔子，肯定能产生相应抗体，然后再用自己制备的血清（多抗）与自己表达的蛋白作western blot，结果明摆着吗：肯定能杂交上。
本人认为：任意一种蛋白刺激兔子后，都能产生相应抗体。那么western blot肯定有结果。
这样做的目的和意义何在？请高人指点！
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【求助】用抗血清来做western blot的一抗有意义吗？
【求助】用抗血清来做western blot的一抗有意义吗？
最新回复
kewanqi2011 (2014-3-17 17:30:40)
is2011 (2014-3-17 17:46:22)
做western的目的是什么,检测目的蛋白的表达而不是检测抗体的产生。
所以使用原核蛋白免疫产生的抗体去检测原核蛋白的表达是不科学的，正如楼主所说即使你纯化出的蛋白不是目的蛋白你的western也可能有阳性结果。但如果换一个角度来分析，使用原核蛋白免疫产生的抗体去检测一些真核蛋白的表达与否，如应用到细胞的westernblot或者免疫组化等实验，所产生的结果就比较可信了。
kewanqi2011 (2014-3-17 17:46:43)
楼上说的没错 ，WB 的最终目的是检测蛋白的表达 ，但是自己做的抗体没有经过验证，是不知道是否产生了能识别抗原的抗体的，而且不是每种抗体都能用来进行WB，所以，楼主这里的WB 是想验证抗体产生与否。
用原核验证只是一个初级的验证，不能完全说明问题，最终是要在细胞系里检测到才能说问题，但是在细胞系里没有检测到并不能说一定没有表达，还有可能是表达量低和WB条件的原因。
原核验证是具有一定的假阳性，可以将质粒转染真核，然后用WB验证，可以检测的到，说明免疫后是有抗体产生。
vivian4123 (2014-3-17 17:47:12)
楼主的问题问的有水平哈
lagua123 (2014-3-17 17:47:38)
感谢各位高手的指点迷津！
其实我是想用Western blot定量检测乳酸菌（原核微生物）的一种组成型蛋白，在菌体经过某种处理之后这种蛋白的表达量同未经处理的菌体的这种蛋白表达量的差异。
但是买不到这种蛋白的标准品，不过我又查到有人（1999年的SCI）用自己纯化的这种蛋白免疫兔子制得一抗，然后来进行western blot！我也想这么做，不知道是否影响发文章！
请高手继续指点！！！
NBA (2014-3-17 17:47:58)
发文章这个问题觉得还的看你发什么样的文章。国内或者国外，国内的杂志也有一个三六九等。
个人觉得你这个试验可能做起来，大的框架是如你所说，蛋白质样品---免疫动物---制的多抗（血清）----用于检测你所说的两组不同的细胞中某个蛋白质的表达情况。
这个思路肯定没有。
如果有疑问看看文献
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WDG-45F533M-1C&_user=2316052&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000056874&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2316052&md5=8a203a8c69fc532b7b11394f6da06e72')
dev bio， if约为5点多
你所问的问题，
lagua123 (2014-3-17 17:49:24)
这个思路肯定没有。
如果有疑问看看文献
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WDG-45F533M-1C&_user=2316052&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000056874&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2316052&md5=8a203a8c69fc532b7b11394f6da06e72')
dev bio， if约为5点多
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其实，我就是想按照这个思路做：蛋白质样品---免疫动物---制的抗血清（作为一抗）----用于Western检测两组不同的细胞中该膜蛋白质的表达情况。
关键是我需要检测的蛋白质是一种细胞膜蛋白，我想用我制备的膜蛋白粗提物（肯定不纯，除了目的蛋白还有别的膜蛋白）直接免疫兔子制得抗血清作为一抗。你说的文献中他是自己合成氨基酸序列，然后免疫兔子，也就是说他是用纯品免疫兔子制得的一抗，或者说标准品。而我要用自己粗提的蛋白质（肯定不纯）来免疫兔子制得的抗血清作为一抗，不知道是否影响发文章（SCI）。
panda王 (2014-3-17 17:49:42)
你这样做能说明什么问题，如果排除免疫的因素，那你的实验结果肯定是阳性，而且膜蛋白粗提物（肯定不纯，除了目的蛋白还有别的膜蛋白）将会导致在westernblot中出现多个阳性条带，文章很难发的。
所以你在制备一抗的时候，尽量使用人工合成的氨基酸片段免疫，或者采用原核表达的方式免疫制备相关一抗。
lagua123 (2014-3-17 17:50:10)
QUOTE:
谢谢战友提醒！人工合成的氨基酸片段免疫会是一个很好的选择！
其实，我要做的是蛋白质定量，只是不知道用测酶活力的方法比较好，还是用Western blot的方法比较好！
bamboo16 (2014-3-17 17:50:30)
一般使用原核表达的蛋白免疫抗体，然后检测不同表达系统如真核表达，或免疫组化等改种相同蛋白的表达情况。抗原免疫动物产生和这个抗原起反应的特异性抗体（WB能够很好地显示该抗原的分子量，说明是一种特异性抗体，而不是非特性抗体）说明这个抗原具有很好的免疫原性。
【求助】用抗血清来做western blot的一抗有意义吗？