【求助】weatern blotting 怎么是空白带啊?

最新回复

• seagate (2014-3-17 21:56:04)

  
  电转没有问题的判断标准是什么？有用丽春红染色确定过？

• birdfish (2014-3-17 21:56:46)

  
  具体说说蛋白大小，转膜条件之类的信息，
  如果按lz所说的都没有问题，那没有条带出来，倒是很奇怪的事情。
  呵呵，开个玩笑。

• ROSE李 (2014-3-17 21:57:27)

  求助的时候最好是把条件具体的写出来，这样比较方便应助的战友分析，如果真是都没有问题，那么为什么没有做出来呢？我认为你应该好好想一想最有可能出问题的地方，从理论到操作步骤。

• purrr (2014-3-17 21:58:19)

  我做EGFR,
  蛋白浓度提出来的有3.4ug/ul左右
  上样量50ug
  电泳80V到底（约三小时），转膜100v 1h，考染胶上有少许蛋白,立春红染膜，可以看见膜上红色条带（比“在线”二字稍微浅一点）
  一抗（upstate）和二抗（博士德）均为1：10000稀释
  封闭3h，一抗四度静止过夜，二抗室温1.5h
  加pierce的supersignal pico A,B液共1ml孵育至少5min，10min左右发现有光带比较明显，分别压片30s，1min，2min，5min，显影1min，放入定影液中马上开灯
  洗膜用的是0.05％的tween的TBST，四次*7min
  片子上什么都没有@_@
  why？是不是上样量不够？还是二抗过稀？
  胶片放入暗合中曝光是可不可以开灯呢？（我想可以，但没试过）

• windboy (2014-3-17 21:58:41)

  一个蛋白是myosin,(220KD)一个是B-tublin(77KD),转膜条件是60V,2小时.

• windboy (2014-3-17 21:59:30)

  
  片子放入显影液要抖片子吗?

• yayya (2014-3-17 22:00:35)

  摇动显影液就行，抖片子不很必要了～

• txwuyan (2014-3-17 22:01:32)

  
  我也遇到过这种情况，很郁闷的：
  最后总结一下：
  1. 我转膜一般是用稳流200mA 1.5h 蛋白marker都转上去去了就没有多大问题
  2. 一抗4度孵育过夜最好放到摇床上
  3. 如果用supersignal pico A,B液处理后能看到光带，说明前边没有什么大问题，绝大部分是定影液的问题！！定影液在用过多次后会很浑浊，定影效果大大减低，所以建议重新配定影液。
  可以剪一小块胶片开灯曝光后放到定影液中检查一下有没有变黑

• coolcool (2014-3-17 22:01:59)

  
  "放入定影液中马上开灯",问题可能就在这,马上开灯片子会暴光的,结果自然是什么也没有