【求助】25kD的目的蛋白做不出来

最新回复

• quiqui008 (2014-3-18 20:37:19)

  
  1一般20KD的蛋白转膜用0.22微米的膜。
  2转膜结束，用丽春红和考马分别染膜和胶，看看是否转膜成功。
  3抗体可以用点杂交来判断有效性和滴度。

• vvmmoy (2014-3-18 20:38:13)

  
  半干转膜的时间条件非常重要，需要摸索！蛋白容易穿过膜。
  还有一个非常关键的问题：你是否确定你拿到了目的蛋白？

• ssonglikihi (2014-3-18 20:38:42)

  谢谢楼上的关注!
  我做的蛋白是insig2,是存在于内质网的蛋白,可能表达不怎么高.当时提的是总蛋白的,不知道怎么搞的,做了几次都做不出来,头都大了.

• ztonyc (2014-3-18 20:39:13)

  
  1.转膜缓冲液中甲醇的浓度增加为20%
  2.转膜时间控制在20v30min-45min或15v1hr左右
  3.用Ecl法显影，敏感度高
  4.抗体用最高的稀释度

• caihong (2014-3-18 20:41:32)

  
  小分子量蛋白不建议用半干转膜，因为电流过大，蛋白容易击穿膜，直接进入对侧滤纸。
  建议试试湿转，110v，转50min左右即可。
  当然，WB能否做出来，还要考虑你的目的蛋白丰度，建议在这种情况下，增大上样量。
  最后一种可能，就是样品质量不好，可能裂解液对于细胞内膜系统的蛋白提取效率不高，建议改进细胞裂解方法，重新制备样品。

• bluelake (2014-3-18 20:41:54)

  
  ----我做的蛋白是insig2,是存在于内质网的蛋白,可能表达不怎么高.--
  我也打算做insig2,不知道您说的是不是SREBP的insig2(Iusulin induced gene2)呢.我觉得提蛋白的时候,不能提总蛋白吧,因为本来insig2含量就很少,提细胞质的吧.这样就要用予实验TUBULIN,HISTON来检测下是否是纯的细胞质.还有加大上样量试下吧.
  还有点想法是,我觉得含量实在太少了,而且很容易裂解的,除了内质网就不存在了,是不是有一种方法能直接提取内质网做WB或者直接能在内质网观察到insig2(非WBlack Eye.
  我的实验方案是这样的,不过还没有开始,还请多指教.我们一起再找找文献吧.您能不能告诉我,insig2一抗是选用什么公司,型号的,谢谢啊.

• jujuba (2014-3-18 20:42:10)

  
  分离胶的浓度要高些吧

• qhyu (2014-3-18 20:42:46)

  我做的是26KD的目的蛋白,也是出不来.请问楼上的,我用12%的分离胶浓度可以吗,还有我是用恒流半干转转膜的,0.8mA/cm2,丽春红染色总见明显的大分子量条带，但不见目的条带，是怎么回事，还请大侠告诉我

• ssonglikihi (2014-3-18 20:55:10)

  我做的蛋白就是insig-scap-srebp转运体系里的insig2
  我们的一抗是santa公司的