【求助】两个小分子量蛋白怎么分离？

最新回复

• cwcwcww (2014-3-18 21:30:55)

  QUOTE:

  原帖由 bongte 于 2014-3-18 21:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我有两对 等电点和分子量 差别都很明显的蛋白，想请教一下高手，该怎么把它们分开？Smile
  1：a蛋白分子量：4.3K PI＝ 8.1
  b蛋白分子量：18K PI=5.2（b是不要的）
  2：c蛋白分子量：9.55K PI＝9.437
  b蛋白分子量：18K PI=5.2（b是不要的）
  纯化之后 ...

  1、分子筛
  2、超滤

• 3N4G (2014-3-18 21:31:48)

  分子筛太慢 而且效果不好
  建议
  1 用10k左右的超滤膜试试分离a和b b和c很难用超滤分开
  2 强烈建议用离子柱分离 很简单 用ph 6.5-7.2的环境上cm柱子 然后收集洗脱就可以 b会被流传

• bongte (2014-3-18 21:32:06)

  这两个体系的蛋白都是Ni柱纯化过的，蛋白酶切后变成两个蛋白，b蛋白有his－tag，所以再走一遍Ni柱 ，会不会有离子交换的效果阿？这两个柱子哪个回收率高些？
  如果再用Ni柱分离的话，还是用咪唑梯度洗脱吗？谢谢

• Darcy (2014-3-18 21:32:26)

  
  蛋白质量不多的话用superdex30分离一天就完事了，不要超滤，损失太大，得不偿失。此外可以用阳离子柱纯化，pH在6.0左右，收集洗脱蛋白就是你的目的蛋白

• youyou99 (2014-3-18 21:32:49)

  
  如果你做抗体只是为了WB，那么我推荐直接跑SDS－PAGE，然后直接按分子量切胶，之后有两个选择，一是做电洗脱，二是直接液氮研磨切下的胶条，直接用磨碎的胶粒免疫小鼠/大鼠，就没问题了，省事，而且得率有保证。电洗脱就不说了吧，第二个选择可以直接搜索“切胶免疫”即可，高人很多啊。

• 白白的 (2014-3-18 21:33:07)

  如果是做抗体 用量不多，可以考虑楼上电泳的方法，另外，有条件的话也可一考虑上rp－hplc 先小体积上看看能不能分开，如能，上200ul或更多， 看着检测结果 在检测器附近手动收样。换言之就是把分析型hplc当制备的来用。
  这招虽然有些笨 但比较“狠” 样品损失小，纯化效率高，做对照品或者结构鉴定时很有帮助。

• bongte (2014-3-18 21:33:36)

  
  最后我选择的办法是柱上酶切，大家帮忙看看我的过程行不行？
  6M尿素溶解包涵体取上清（样品中目的蛋白条带清晰）－－含6M尿素、20mM咪唑的binding buffer平衡Ni柱－－上样－－6M尿素、20mM咪唑的wash buffer洗脱－－6M尿素、40mM咪唑的wash buffer洗脱－－肠激酶缓冲液洗柱－－加10ul肠激酶的缓冲液保留在柱上－－25度16小时－－肠激酶buffer洗脱电泳结果没有我要 的9KD的条带(12%SDS-PAGE应该没跑出去，14k条带离下面还有两厘米呢)
  1. 难道是我的EK加少了？还是最后洗脱的时候，肠激酶buffer洗脱不下来？
  2.我判断我的样品应该还在柱上，所以我决定咪唑梯度洗脱，不加尿素了，行吗？
  3.加了尿素的咪唑洗脱缓冲液（用于Ni柱蛋白变性洗脱的）能在4度长期保存吗？不能的话多久会失效？

• bongte (2014-3-18 21:34:52)

  样品用6M尿素和50-200mM的咪唑洗脱后，样品直接送公司做多抗可以吗？需要冷干吗？要是透析的话，我前些天也做过，用肠激酶Buffer透析出现好多沉淀，沉淀跑电泳也不是我的蛋白，上清里面也没有我的蛋白，所以不想透析，直接送样做多抗没关系吧。
  因为我们实验室不做动物，所以要去外面做多抗