【求助】考马斯亮蓝法测定蛋白疑问？

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• gemei0115 (2014-3-18 21:41:56)

  
  1.首先问一下，你用的是试剂盒还是自己配的溶液？如果是自己配的，贮液是否茶色？因为CBB-G250假如配制方法不对，有可能配出来就是蓝色，那样是测不准的。
  2.你的蛋白质溶液介质是什么？一定不能有去垢剂（比如SDS）！
  3.参比用的什么？保证除了蛋白质以外，其余成分完全一样。
  4.你预计蛋白质浓度有多少？是否足够显色？
  5.最后想到的一点，可能性不是太大，但是上周我们刚遇到的事实：上面说的几个方面都没问题，肉眼都可以看到颜色差异，但就是测不出来。分析了半天原因，结果是分光光度计坏了…………
  希望能有所帮助。

• yapuyapu (2014-3-18 21:42:17)

  OD值为负值 这种情况我遇见过 1.首先要考虑你的空白对照 对照颜色不能太深 ，否则的用水再作对照的对照 2.蛋白含量不能太高或太低，一般OD在0.1－0.5之间 3.考虑仪器问题
  解决方法：
  用100ug/mlBSA作对照检验你的体系 ，如果浓度太大，稀释后再测；换台仪器试一下

• cocacola (2014-3-18 21:42:38)

  
  OD值为负值与蛋白浓度有什么关系吗?

• 兔纸 (2014-3-18 21:42:56)

  我也遇到过这种情况,是分光光度计的盖子没关好...

• yapuyapu (2014-3-18 21:43:19)

  OD值为负值 从理论上讲是不可能的 正如上面这位仁兄所说是盖子没盖好，或者是你的待测管比标准管颜色深，如果是后者的话，你就应该用蒸馏水作对照，用化学的比色法来测定

• idoww (2014-3-18 21:43:43)

  
  我以前遇到过一次，就是因为溶液里面有SDS，去污剂的影响还是挺大的，好好看看溶液的成分吧。

• whitesheep (2014-3-18 21:44:08)

  
  那跑SDS-PAGE的样品想要定量怎么办啊？我也是样品老是负值。是不是SDS,尿素都会影响结果？那怎么测那？

• biabiade (2014-3-18 21:45:15)

  用BCA法测好了,基本不受影响.西西

• applebook=213 (2014-3-18 21:45:36)

  
  呵呵...看来老弟也被困在蛋白上了!
  OD是负值可能有几个原因,上面的战友都讲的很好!
  1.先从源头查,保证配制的BRANDFORD溶液没问题,在配制时候一定要先用乙醇完全溶解了,在加磷酸和水.
  2.消除你溶解蛋白的背景,比如说你样品是稀释30倍,那么你在配制BSA标准品的时候裂解液也要稀释30倍,尽量减少背景造成的误差;
  3. 测浓度之前,最好是先估测你样品的浓度,太大超出线形范围,太小了几乎与空白一样,
  4.配制标准品还是样品稀释一定要准确,充分混匀也很重要,而且在往孔里加液体时,最好谨慎的保证每个孔都是一样体积,千万别小看枪头遗剩的液体,
  5.我每次测定是都平行3个样,去平均数,不知道你是怎么测定
  6.样品加入后震荡混匀,先肉眼观察,若样品浓度在范围内的话,颜色有相应的对比,自己心里先有点数,等读数出来后,就有大概的估测了.
  7.保证酶标仪的设定是正确的,而且能健康的工作...
  祝你好运....

• leifengta (2014-3-18 21:45:57)

  我也是啊，与空白样比较吸光度为负值，不明白希望好心人帮忙，另外光度计归零的时候跳动个不停，不知怎么回事啊，同问

• gogo (2014-3-18 21:46:17)

  
  我刚买的考马斯亮蓝-R250不知道是不是一样的用呢?

• kuaizige (2014-3-18 21:46:42)

  
  考马斯亮蓝-R250不适用于蛋白定量。原因见下：
  考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
  考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
  通常考马斯亮蓝R250是电泳染色用的，考马斯亮蓝G250是测浓度用的。
  当然也有用R250染色的但重复性不如G250，所以如果溶液中蛋白浓度很低可用R250，同时每次要做好标准曲线，否则最好用G250。
  

• remenb (2014-3-18 21:47:00)

  
  我遇到这问题了，为负值，测了两遍，还是负值。原则上不应该为负值，但确实是，机子没问题，作的是标准曲线所以不存在表面活性剂等试剂的干扰问题，请教各位高手，问题该怎么解决!