【求助】 2D电泳图

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• damingxia0904 (2014-3-19 10:33:41)

  
  蛋白上样量：约900ug，考染。
  IPG条：Pharmacia公司的18cm，PH3-10。
  IEF电泳条件：（Bio-Rad电泳仪）
  水化：被动，12h
  250v，30min
  1000v, 快速, 1h
  10000, 线性，5h
  10000v，60000vhr
  500v， 5h
  在实际电泳时，电压达到10000v，但是最后一步不知怎么还是10000v，这个准备咨询biorad的工程师。
  平衡：
  第一次：10ml平衡液＋100mg DTT， 15min
  第二次：10ml平衡液＋250mg 碘乙酰胺， 15min
  sds电泳条件：
  12％的胶跑了约6h。（这个sds－page系统也是biorad的，平时跑其它的电泳比如蛋白表达没出现纵向条纹的问题）。
  请高手帮忙分析一下。
  另：请问各位高手定量用哪种方法？Bradford不太准，Lowry法又不能用（试过，裂解液严重干扰结果），跑个电泳再扫描图像吧，误差还挺大。

• damingxia0904 (2014-3-19 10:37:46)

  
  刚才又咨询了别人，建议减少蛋白量，用银染的办法，但是我老板又说如果银染的话，后面挖点测序分析可能又会有问题，是这样么？

• guagua (2014-3-19 10:38:15)

  
  上样量太高了，我们一般上500ug就可以了。定量用G250的方法就可以了，挺准的

• damingxia0904 (2014-3-19 10:38:32)

  
  如果上500ug，考染能否染出来？

• H2O (2014-3-19 10:38:55)

  QUOTE:

  原帖由 damingxia0904 于 2014-3-19 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  刚才又咨询了别人，建议减少蛋白量，用银染的办法，但是我老板又说如果银染的话，后面挖点测序分析可能又会有问题，是这样么？

  
  LZ可以先用银染的方法分析出蛋白差异点，再用考染的方法取点做质谱。考染可采用Blue silver胶体考染法，一种改良的考染，比普通的考染灵敏度高，与质谱的兼容性好，具体的方法有很多帖子，lz可以搜索下。

• H2O (2014-3-19 10:39:25)

  QUOTE:

  原帖由 damingxia0904 于 2014-3-19 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  蛋白上样量：约900ug，考染。
  IPG条：Pharmacia公司的18cm，PH3-10。
  IEF电泳条件：（Bio-Rad电泳仪）
  水化：被动，12h
  250v，30min
  1000v, 快速, 1h
  10000, 线性，5h
  10000v，60000vhr
  500v， 5h
  在实际电泳时，电压达到10000v，但是最后一步不知 ...

  从2D胶上看，蛋白点聚焦不太好。建议增长低电压除盐的时间，可以250v，500v，1000v各1h后，再升压至10000v，聚焦的vhr可增加到70000－80000。聚焦完成后，最好不要再用低电压维持，这样不利于碱性端的聚焦。
  另外，蛋白定量可以用Amersham的2D蛋白定量试剂盒，效果不错。
  祝实验顺利！

• damingxia0904 (2014-3-19 10:39:51)

  谢谢大家！
  我先试试您的方法，将低压除盐时间增加。
  还有，考虑将蛋白量降到400ug，有点担心考染不出来。

• H2O (2014-3-19 10:40:16)

  QUOTE:

  原帖由 damingxia0904 于 2014-3-19 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  谢谢大家！
  我先试试您的方法，将低压除盐时间增加。
  还有，考虑将蛋白量降到400ug，有点担心考染不出来。

  18cm，PH3-10干胶条，如果做考染的话，蛋白量400ug估计有些少了。一般是800ug左右。我们实验室制备质谱胶粒时，blue silver胶体考染上样量为1mg。效果还不错。

• damingxia0904 (2014-3-19 10:40:38)

  我看了一些帖子，准备用blue silver法。
  请教michelle_zhul：您用这个方法究竟怎么配制染色液，步骤怎样？
  以下是网上的资料：
  一、染液配制：
  染色液（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇，总体积500ml）：
  1：取42ml H2O+58ml H3PO4（85％）烧杯中混匀，再称取50g 粉末状（NH4）2SO4倒入烧杯，搅拌至完全溶解，如果难溶，加一些水。
  2：加入 0.6g G-250 长时间搅拌，最后倒入量筒用水定容到400ml 。
  3：量取100ml甲醇，边搅拌边加入，搅拌均匀。
  二、染色
  固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;
  水洗: 去离子水 15min × 4;
  染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜。染色时间约13小时。
  3、脱色: 去离子水洗。盛胶槽中的颗粒状染料不易洗去，建议脱色时更换盛胶槽。

• H2O (2014-3-19 10:40:59)

  QUOTE:

  原帖由 damingxia0904 于 2014-3-19 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我看了一些帖子，准备用blue silver法。
  请教michelle_zhul：您用这个方法究竟怎么配制染色液，步骤怎样？
  以下是网上的资料：
  一、染液配制：
  染色液（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇，总体积500ml）：
  1：取42ml H2O+58ml H3PO ...

  染液的配制及固定染色的步骤是按LZ所写的进行，我一般是固定30min。
  另外，建议LZ在做分析型2DE时还是采用银染比较好，上样量小，灵敏度又高。
  祝实验顺利！

• caihong (2014-3-19 10:41:18)

  
  在上样量上我们实验室也摸索了很久，最后定下来是500ug，用blue silver的方法染色。我觉得上样量的大小还是和材料有关系，我们隔壁实验室用苔藓材料，18cm的胶上样1mg，结果很好。但是我们的就不行，最终减少到500ug才得到好的结果。

• damingxia0904 (2014-3-19 10:41:36)

  
  我的2D图上为什么有纵向条纹呢？

• damingxia0904 (2014-3-19 10:41:58)

  
  
  第二次电泳图：

  
  88539118.snap.jpg

• damingxia0904 (2014-3-19 10:42:20)

  
  蛋白上样量：500ug，blue silver染色。
  IPG条：Pharmacia公司的18cm，PH3-10。
  IEF电泳条件：（Bio-Rad电泳仪）
  水化：被动，12h
  250v，30min
  1000v, 快速, 1h
  10000, 线性，5h
  10000v，60000vhr
  500v， 30min（实际没等这个时间，直接关机了）
  平衡：
  第一次：10ml平衡液＋100mg DTT， 15min
  第二次：10ml平衡液＋250mg 碘乙酰胺， 15min
  sds电泳条件：
  12％的胶跑了约6h。
  个人意见：
  1、蛋白主要集中在酸性区域，
  2、还是有不少横向、纵向条纹。
  下步方案：
  1、采用bio-rad的pH4－7的胶条；
  2、重新配制裂解液与平衡液。
  各位大侠帮忙分析一下。

• u234 (2014-3-19 10:42:37)

  
  我觉得可以换成4-7的跑一下看看，另外，酸性端的那一团，可能是高丰度蛋白的脱尾，或者是核酸干扰。

• H2O (2014-3-19 10:42:57)

  
  LZ第二张电泳图已经进步很大了啊！酸性端的蛋白点聚焦的不错，碱性端还有些横纹，建议聚焦的vhr可增加到75000－80000(毕竟碱性端比酸性端难聚焦)，可以改善碱性端的横纹，及碱性端蛋白点的聚焦效果。我以前实验时对比过。
  如果聚焦的vhr增加到80000后，碱性端蛋白点还是很少，lz可以换成pH4－7的胶条再试试。
  Good luck！

• damingxia0904 (2014-3-19 10:43:34)

  各位园友，这是小弟我第三次跑的2D图：
  Bio-Rad的PH4－7胶条，17cm。
  蛋白上样量：680ug，blue silver染色。
  IEF电泳条件：（Bio-Rad电泳仪）
  水化：被动，12h
  250v，30min
  1000v, 快速, 1h
  10000, 线性，5h
  10000v，60000vhr
  500v， 10min
  平衡：
  第一次：10ml平衡液＋100mg DTT， 20min
  第二次：10ml平衡液＋250mg 碘乙酰胺，20min
  sds电泳条件：
  12％的胶跑了约6h。
  个人观点：
  1、比前2次有很大的进步；
  2、在碱性端有一很粗的纵向蛋白条纹，说明在PH7上还有不少蛋白。

  
  64955658.jpg

• duoduo (2014-3-19 10:45:45)

  
  样品处理时不错的
  IEF电泳条件：（Bio-Rad电泳仪）
  水化：被动，12h
  250v，30min
  1000v, 快速, 1h
  10000, 线性，5h
  10000v，60000vhr
  500v， 10min
  －－－－－－－－－
  这程序好像在１０００ｖ到１００００ｖ间少了一步
  １００００ｖ　０.５ｈ　ｒａｐｉｄ
  不然你就是在５个小时内让电压从１０００ｖ升到１００００ｖ
  最后一次不错，用１７ｃｍ　ｐＨ　３－１０　ＮＬ看看

• duoduo (2014-3-19 10:46:03)

  
  同样道理，从１００００ｖ到５００ｖ间要加一小步