【求助】Tricine-SDS-PAGE

最新回复

• yes4 (2014-3-19 14:37:25)

  
  配方和步骤如下：
  cuturl('http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/goldberg/tricine.html')
  槽子是一样的。主要区别是电泳缓冲液分正极和负极
  内槽负极，外槽正极，PH值不同，注意夹紧不要漏液

• summerxx (2014-3-19 14:37:51)

  
  Tris-tricine缓冲系统电泳
  一 试剂及缓冲液
  （1）  阳级缓冲液（0.2mol/L Tris-HCl ,pH 8.9）
  将121.1g Tris碱溶于500 m1水中，浓 HCl调pH至8.9。用水稀释至5L，于4℃可保存一个月。
  (2)阴极缓冲液
  12.11g Tris (0.1 mol/L)
  17.92g tricine (0.1 mol/L )
  1g SDS [0.1%(m/V)]
  用水稀释至1L，
  缓冲液的pH应在8.3左右，于4℃可保存一个月。
  （3）30%T 丙烯酰胺贮存液
  在100 m1水中加入29g丙烯酰胺和1g 双丙烯酰胺。经Whatman 滤纸过滤后，于4℃ 保存。每过几星期应重新配制丙烯酰胺贮存液。
  （4）Tris•Cl /SDS, pH 8.45
  在300ml水中溶解182gTris（3.0mol/L）, 用1 mol/L的HCl调校至pH 8.45，补水至总体积500ml。用0.45滤膜过滤溶液，再加入1.5gSDS[0.3%(m/V)], 于4℃可保存一个月。
  （5）8×Tris•Cl , pH 6.8
  在40ml水中溶解6.05gTris（0.5mol/L）, 用1 mol/L的HCl调校至pH 6.8，补水至总体积100ml。用0.45滤膜过滤溶液， 于4℃可保存一个月。
  胶配方
  分离胶和浓缩胶
  储存液  分离胶  浓缩胶
  丙烯酰胺贮存液/ m1  9.80  1.62
  Tris•Cl /SDS, pH 8.45  10.00ml  3.10ml
  H2O  7.03  3.10
  Glycerol  4.00g(3.17ml)  -
  10%过硫酸铵/ m1  0.05  0.025
  TEMED  0.01  0.005
  本配方可得30ml 分离胶和12.5ml 浓缩胶
  2×Tricine 样品缓冲液
  2ml 4×Tris•Cl, pH 6.8 (0.08mol/L)
  2.4 ml (3.0g) 甘油 [24%（V/V）]
  0.8g SDS
  0.31g DTT
  2mg 考马斯蓝G-250，
  加水至10ml，并混匀
  步骤
  1）  配制溶液并灌制分离胶和浓缩胶
  2）  制备样品，采用2×Tricine 样品缓冲液，加样前样本于40℃处理30-60min。
  3）  在电泳装置中分别加入缓冲液
  4）  连接电源，在30V恒压下电泳1h后，接着在150V恒压下电泳4h。
  5）  当考马斯蓝G-250示踪染料到达凝胶的底部时，将电压调回零并断开电源。
  6）  考马斯亮蓝染色

• dongdongqiang (2014-3-19 14:38:13)

  为什么我看的很多资料里面都是三层胶啊？

• dongdongqiang (2014-3-19 14:40:56)

  
  我想请问一下，灌胶的时候是注入分离较后就接着注入夹层胶和浓缩胶，还是和普通PAGE一样，加水封胶等两个小时以后再灌别的胶？

• DONT (2014-3-19 14:41:16)

  注入分离胶后，水封或者0.1%SDS封，胶凝了，就可以加夹层胶，依次类推加浓缩胶。

• 831226 (2014-3-19 14:43:50)

  
  昨天试着跑了一下，5C+尿素的那种两层胶
  染色一晚上，竟然缩小了好多。。就像胶干了一下，可是其实没干，就是缩小了。
  不知道为什么~也没条带
  之前跑的是三层的Tricine-SDS-PAGE，虽然目标条带有点散，可是还是能看到的。
  不知道它怎么会缩小好多？

• 2541 (2014-3-19 14:44:05)

  
  配置染色液时甲醇(或乙醇)加的太多了,把水"吸"出来了,把胶放入水中,可恢复一些.配置染色液时可以降低甲醇(或乙醇)的用量来试试