【求助】SDS-PAGE怪事

最新回复

• zranqi_1 (2014-3-21 11:07:41)

  
  可能是这两个问题，你胶配的不好，胶凝的时间不够；上样前，蛋白变性不完全。

• 8princess8 (2014-3-21 11:08:05)

  
  可能是你的浓缩胶里忘了加SDS或者加的少了。蛋白质带的电荷量不够，怎么可能跑下去吗！

• sunshine039 (2014-3-21 11:11:08)

  
  谢谢！
  昨天我又跑了一次，在跑的过程中溴芬兰呈现出各种奇形怪状的样子。但是颜色正常。更夸张的是到了底部居然变成黄色的了。取胶的时候还闻到一股焦臭，我也形容不出来。检查发现仪器能正常运行，没有问题。
  我打算换台电泳仪，为了增大上样量老板叫我用的国产的电泳槽，但是我们没有配套的电压装置，所以和Bio-RAD的组合着做的，多多少少会有影响吧。感谢各位的指点，我再好好注意一下这些问题。

• flower-201 (2014-3-21 11:11:35)

  
  一般来说，电泳槽和电压装置最好配套使用，但是电源装置用别的品牌问题不大。
  可以这样筛查：
  用现在的试剂配一块胶，把别的同学验证过没有问题的样品和你的样品加在不同孔道，同时跑胶，然后染色，看结果。
  如果同学的样品显示好，你的显示异常，说明是你的样品问题。
  如果同学的样品和你的样品都显示异常，说明是试剂或操作，仪器的问题。
  从你所说的分析，样品可能性大。请按上面所说的做后，将结果告诉我，进一步分析。
  祝实验顺利

• sunshine039 (2014-3-21 14:43:43)

  今天又做了一次，结果还没有出来。跑的过程中有拖带的现象，我也开始怀疑我的样品了。
  我们用的缓冲液是分开的，要不在她做的时候我也加一个样品，再看看结果。有问题的话还请不吝赐教。

• DNA (2014-3-21 14:44:38)

  可能就是配胶的问题
  建议新鲜配制10％过硫酸铵；
  灌好胶后真空抽一下，用异丁醇压分离胶。
  缓冲液也一定用新鲜的

• 831226 (2014-3-21 14:46:30)

  
  没有那么多需要注意的，任何一个实验书上找一个protocol，认真点做，没问题的
  要有自信
  从配胶到染色都严格按程序做，因为确实有很多的注意事项，你照着程序做就好。
  你的Marker可能不好，loading buffer not good, 样品可能处理得不好，是不是有很多盐没有除净，样品处理不好就会有很多种可能导致这样的结果

• bamboo16 (2014-3-21 14:47:36)

  
  请问凝好的胶可以马上上样电泳吗？
  好像听人说要放一段时间再用效果才好。

• xyw5 (2014-3-21 14:48:05)

  
  “谢谢！
  昨天我又跑了一次，在跑的过程中溴芬兰呈现出各种奇形怪状的样子。但是颜色正常。更夸张的是到了底部居然变成黄色的了。取胶的时候还闻到一股焦臭，我也形容不出来。”
  溴酚蓝变黄是因为下级电极缓冲液pH变低的缘故，很正常的。很多时候电泳时间久了，溴酚蓝跑到下级边缘都会出现这种现象，包括出现锯齿状波纹等。但并不影响蛋白的电泳行为和分离效果。你看不到条带，但没说明泳道是否着色。如果泳道成弥散的着色一片，可能是因为你样品上样量太多了，或者样品中有太多的其它物质如PEG等影响了。如果确定是样品少，可以加大上样量，同时用银染方法染色。
  如果marker也不成带，可从一下方面考虑：1，胶制得不好，尤其是催化剂太多，胶凝集太快，因而不均匀；2，缓冲液ph不对；3缓冲液组分不对，没加SDS等；4，电极缓冲液没配对（千万别忽视这条，我严重怀疑是造成你的电泳不成带的原因）。

• sunshine039 (2014-3-21 14:48:38)

  
  有这么多热心的人对我的实验给予指导，真是万分感谢！
  到目前，我最后这次的电泳终于把marker跑出来了。
  正如byd123 所说，同学的样品跑出来了，我的却没有。问题应该就出在我的样品的问题上了。
  luotx提出的“如果泳道成弥散的着色一片，可能是因为你样品上样量太多了，或者样品中有太多的其它物质如PEG等影响了。如果确定是样品少，可以加大上样量，同时用银染方法染色。”我一直怀疑是上样的量太少，也试过银染，没有染出想要的目的条带。
  可能就象milkyway所说，有很多盐没有除净，我溶解的时候把盐也当成目的蛋白了，稀释倍数太多。现在准备重新浓缩，重新提纯一批样品再跑电泳。

• ffaa (2014-3-21 14:50:04)

  
  1 SDS 会影响条代的情况，查查你配胶的SDS母液的浓度。
  2 样品中盐浓度高影响不大，你可以跟同学要点LOADing 缓冲液，或者去公司买点。
  3 你说电泳后面的时候溴芬蓝变成黄色，提示你的分离胶的PH不对，检查一下下层胶的TRIS母液的PH值。
  4 电泳缓冲液是直接把甘氨酸、tris、SDS混和的，千万不能调PH，调了一定会出问题！