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【求助】测序正确，western blot无条带
在一个原核载体中插入lac promoter+signal sequence＋protein。如图，测序我也标出了前面一段的读码框，基本排除了稀有密码子的问题。目前的问题是：【求助】测序正确，western blot无条带
1. 载体中本身已经有了一个lac promoter，在该基因之后，lac z 之前。一个载体中有2个lac promoter,即使IPTG诱导，也有可能检测不到目的蛋白的表达。？
2. 不知道还有其他的影响表达的原因么？
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最新回复
gmjghh (2014-3-21 17:34:57)
在一个原核载体中插入lac promoter+signal sequence＋protein。如图，测序我也标出了前面一段的读码框，基本排除了稀有密码子的问题。目前的问题是：
1. 载体中本身已经有了一个lac promoter，在该基因之后，lac z 之前。一个载体中有2个lac promoter,即使IPTG诱导，也有可能检测不到目的蛋白的表达。？
2. 不知道还有其他的影响表达的原因么？
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gmjghh (2014-3-21 17:36:35)
蛋白是BtsI单酶切插入的。
目前
1. 将lac promoter换成tac
2. 将目的基因 signal sequence+ protein插入lac z a区域。若用IPTG诱导，是否可行？
插入片段中我已经加入了一段HA- tag，以作western blot 检测。
希望得到大家的帮助。着急毕业啊！！
谢谢！
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am10 (2014-3-21 17:37:27)
你在上述帖子中提到的主要是载体的设计构建的问题，但是你的载体和表达菌分别是什么？诱导的条件步骤具体的罗列一下可能更有帮助解决问题。诱导表达的影响因素很多，如果比较详细的列出实验条件，可能更便于分析。
gmjghh (2014-3-21 17:37:54)
QUOTE:
对的。我的任务就是构建载体。载体是噬菌体M13KE,细菌是：ER2738， NEB推荐的菌种。
诱导条件：
3ml LB+60ul O.N.E.coli+2.5ul phage, 37度 175rpm， 2.5hrs;
取400ul 转移到40ml LB中，175rpm 1h;
加入0,8mM IPTG诱导表达 6hr 175rpm 37度
离心，取上清，PEG沉淀过夜后再高速离心，用TBS溶解沉淀后跑SDS-PAGE和Westernblot
其实我现在担心的是，这个蛋白根本就没有表达。
gmjghh (2014-3-21 17:39:04)
QUOTE:
1和2 都作了。
还是没有表达。
怎么办啊？
98776langtao (2014-3-21 17:39:49)
试着提高温度，如 40度，42度诱导看一看。有没有目的条带的出现
gmjghh (2014-3-21 17:40:49)
现在只能是先把我这段蛋白先放到表达载体上看看能否表达先。
因为我的目的是构建新的载体，并不单纯是表达蛋白。而是
1. 看我插入的那个基因能否表达
2. 看该基因上能否表达我的目的蛋白。
如图是我的目的载体。我是在Bts I处插入了一个recombinant gIII。目前就是
1. 用anti-pIII来检测pIII的表达。奇怪的是，即使没有插入该gIII的载体，也能显示2条带；
2. 在2个gIII的signal sequence 和后面的蛋白之间插入一段tag, 如HA 和C-MYC,用来检测表达。目前是：只有wildtype pIII有条带，recombinant pIII上的没有表达。
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bamboo16 (2014-3-21 17:41:13)
我觉得也是你的蛋白没有表达.
caihong (2014-3-21 17:41:43)
plaa (2014-3-21 17:42:04)
1一个载体中含有两个相同的Promoter, 彼此间可能产生竞争，导致蛋白表达量降低.可以扩大反应体系并浓缩蛋白样品后再检测
2，不知道你所表达的蛋白是否一定能够分泌出来？如果不是外泌性的， 干脆把细菌沉淀裂解后来检测。
3，你提到： “用anti-pIII来检测pIII的表达。奇怪的是，即使没有插入该gIII的载体，也能显示2条带；“。这话让我很怀疑目前使用的体系是不是有什末问题。
有时候构建出来的载体不能表达目的蛋白，想搞清楚原因十分困难，还不如换个 载体重新构建来的简单。
祝好运
gmjghh (2014-3-21 17:42:33)
QUOTE:
我写信问了NEB的，关于为什么会有2条带，人家说，一条是degraded。具体也没说。这个载体已经被报道过是可以这么构建的。我也写信去问了人家，可人家说，他们很快就work了，没出现我这样的状况。
我也把诱导我的蛋白的lac换成tac了，也还是没用。也把细菌裂解后检测，只是多了些杂带。
真的想不到还有什么原因了。
fsdd817 (2014-3-21 17:44:05)
楼主及时回复信息，讨论深入，加分鼓励，希望能更进一步深入讨论，看看能否解决问题
我的几点看法，供参考：
1。首先判断是蛋白“没有表达”还是“表达量低”，这个是有本质区别的
加大表达的体积、浓缩蛋白、加大上样量、提高监测灵敏度（Western、ECL）。。。。总之是判断清楚是否确实没有表达
2。若表达了只是量低，只需优化表达条件就行了，甚至不摸索，干脆发酵个几升浓缩拿到蛋白，反正毕业着急吗
3。若是确定没有表达就比较麻烦了，毕竟是异源表达，很不好说清楚的
可以考虑先换表达宿主（这个最容易，再做次转化就行了），只要表达载体可以用的宿主都试试；
如果不行就换表达载体，麻烦一些，但是一般只需酶切、连接、转化，看看效果如何；
再不行可能就说明该蛋白很难在该原核表达体系中表达了，那就需要换表达体系了，希望不会这样吧，快毕业了，时间很重要。。。
祝一切顺利~~~~
gmjghh (2014-3-21 17:44:36)
QUOTE:
多谢版主鼓励。我自己的判断是：蛋白并没有表达。目前所采用的检测手段是western blot。我也考虑过提高表达体积，目前为40ml，但是体积加大后，用WB 会出现比较多杂带；显色时间长，杂带也增多。
下周会考虑换个e.coli试试。（NEB的人回信说，他们提供的ER2738已经非常强大了。）
并且会把这段基因放到pET表达载体上看看到底能不能表达了。
附件里我把我插入片段的序列贴上来了。大家帮我看看有没有什么地方出错的。
【求助】测序正确，western blot无条带