【求助】目的蛋白12kd和30kd的杂蛋白用了凝胶柱为什么...

最新回复

• ROSE李 (2014-3-23 20:48:12)

  
  利用体积排阻的方法精度可能不太高,你试一下电泳技术!

• ROSE李 (2014-3-23 20:48:38)

  QUOTE:

  原帖由 HP007 于 2014-3-23 20:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请教高手，我用的是sepahdexG50 和G75直径1.6cm长1m的自装柱，还试过sephacryl S100，效果都不好，目的蛋白总是和杂蛋白分不开，这是真么回事啊？我想试试G100可以吗？
  另外，我的蛋白是从包涵体复性后得到的。等电点约为9. ...

  
  从理论上讲，1.2kd和3kd的蛋白应用G50和S100是应该能够分开的，但S100分离程度相对要弱一些。而G75的分离效果不好，因为超过了其分离的下限。
  分离效果不好可能原因有几个：首先要注意装柱一定要均匀，以保持较高的理论塔板数；其次要注意层析时的流速和压力，流速过大或过小都会影响其分离效果；同时还要注意上样的体积和浓度（浓度大的黏度大），以及可以在分离缓冲液中可以适当加点盐，以消除蛋白质之间的范德华力等分子间作用力。

• HP007 (2014-3-23 20:50:22)

  
  我上样量是柱体积的1%，浓度一般在10mg/ml，流速0.5ml/min

• HP007 (2014-3-23 20:51:50)

  对不起，是我写错了。我的目的蛋白是12kd杂蛋白是30kd，请问应该怎么选择柱材料？

• lorri (2014-3-23 20:54:41)

  
  样品中加1mM β巯基乙醇，150mM NaCl .
  流速并非越小越好，像你这样的柱子(内径1.6)流速在1.0ml/min 分辨率较高.如果实在不行，再加点5%glycerol 一试

• HP007 (2014-3-23 20:55:54)

  QUOTE:

  原帖由 lorri 于 2014-3-23 20:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  样品中加1mM β巯基乙醇，150mM NaCl .
  流速并非越小越好，像你这样的柱子(内径1.6)流速在1.0ml/min 分辨率较高.如果实在不行，再加点5%glycerol 一试

  β巯基乙醇是有毒的吧？做药物应该不能加的。
  加 NaCl 和glycerol 的作用是什么呢？

• lorri (2014-3-23 20:58:55)

  看你的蛋白是什么用途了，并非是药物蛋白就不可用β巯基乙醇，再说它本身很容易被氧化，用了还可以再透析除去。
  NaCl 是预防sephadex,superdex,sephacryl 因本身本底电荷所引起的离子吸附。
  glycerol 是降低蛋白之间的一些疏水作用。（考虑到你的两个蛋白可能通过疏水作用力而粘联）