【求助】bis-tris胶不凝怎么办，就算是凝里效果也很差！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-23 22:23 作者: 131415 来源: 分析测试百科网

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【求助】bis-tris胶不凝怎么办，就算是凝里效果也很差！

用Bis-tris系统跑小分子量蛋白,但效果不理想,这个BIS-tris的胶也太难配了，下层胶要凝3个小时，上层胶要凝2个多小时，还经常出现胶的质量很差，不平整，样品在浓缩胶里就是跑不下去，想请问高手是怎么回事？
而且每次加了梳子以后，那个上样孔总是歪七扭八的，没法上样。
另外我在SDS-PAGE里跑出来的MARK，总是在浓缩胶就开始出现MARK里的约98分子量的条带，不知是为什么。

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yes4 (2014-3-23 22:24:56)

是以前就这样还是最近才出现的?溶液是一直用的还是最近新配制的?凝胶浓度多少?室温多少?温度低凝的会慢一些,APS是不是新配制的,仔细分析下能找到原因的
ero11 (2014-3-23 22:25:12)

建议配胶的各个成分重新配制，尤其是AP，新配的4度能放2周，-20度时间长一点，但是会随着时间延长而效力降低
131415 (2014-3-23 22:25:31)

不是AP的问题，这个AP用在其他的胶里是好的，
我是刚开始做这种胶，一直都是这样不好，室温是10度
ero11 (2014-3-23 22:25:51)

QUOTE:
原帖由 131415 于 2014-3-23 22:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
不是AP的问题，这个AP用在其他的胶里是好的，
我是刚开始做这种胶，一直都是这样不好，室温是10度

你的 AP是分装的还是临时配制的？上次用和这次间隔多长时间了？
详细参考：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=10611095&sty=1')
yhz1973 (2014-3-23 22:26:18)

1，因为AP和TEMED是促进胶凝固的，所以必须保证这两个东西还有效。
2，温度对于胶的凝固作用也很大，可以放到37度温箱，半小时就凝固得很好。
sunnyB (2014-3-23 22:26:38)

tris的ph值也很重要，浓缩较ph值高了就不凝或者很慢，ph值6.8很快会凝得
101010 (2014-3-23 22:26:56)

把AP和temed的用量加倍尤其是TEMED的量三倍也可以
小荷尖尖 (2014-3-23 22:27:22)

楼上说的对
AP，TEMED和光是两者聚合的催化剂。
没问题一般都会凝！
damingxia0904 (2014-3-23 22:29:38)

你的胶要凝3个小时，这个太夸张了，我天天都做WESTERN bolt ，没你那种情况啊，
现在是冬天，胶凝的慢是正常的，不过我配的胶，分离胶一个小时，基层胶也就十几分钟，肯定都凝了，
首先，你要保证你是按照顺序一个不漏的把水，30%丙烯酰胺，tris（ph8.8），10%sds，10%过硫酸铵和TEMED等六种成分都加进去了，
这里要注意的是，
1、分离胶tris的ph是8.8，基层胶的tris是6.8，不能搞错，
2、过硫酸铵，要注意使用时间，我们一般配的是1ml，室温保存，在一周之内使用，时间长了，就不用了，所以检查一下你用的过硫酸铵是不是有问题，
3、还有是TEMED，这是比较容易出问题的，因为它量小，用移液器吸的时候，要确保吸到那4-5微升，然后加的时候也要确保加到混合液中，
我们可以在加TEMED的时候将tips伸进液面以下，然后打出TEMED，打出TEMED的过程，我们是可以看到它从tips里被打入的试管里的，这个只要你以后配胶的时候注意一下，就容易看见的。
为什么这里我对楼主说了这么多，是因为本人刚开始配胶的时候有好几次，也不理想，很可能和TEMED漏加，少加，或者加的不合适导致的，因为它是一个催化剂，没有它，可想而知，胶是不会凝的。
4、还有就是，各种成分都加进去之后，要注意混匀，是各种成分有效作用，这样才可以使胶凝好。
至于你说的，凝了的胶它的质量也很差，如果你正确的配好了胶，胶也凝了，那么以后的工作中影响胶的，包括，拔梳子时要垂直拔出，如果七倒八歪的拔除，本来梳齿间的胶柱和两层玻璃板间有一定粘合性，那梳齿的影响，则会让胶柱游离；
还有拔出梳子后用去离子水冲洗梳孔内残胶的时候，水压不要太大，以免冲脱胶柱，这也会使上样的时候胶孔不整，影响上样。
最后，配好的胶可以往梳孔里加注水，用保鲜膜包起在4度保存，翌日，跑电泳。也可以配好后就跑。这都没有问题的。
祝实验顺利！
xiaoxiaoniao (2014-3-23 22:30:06)

QUOTE:
原帖由 yhz1973 于 2014-3-23 22:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

1，因为AP和TEMED是促进胶凝固的，所以必须保证这两个东西还有效。
2，温度对于胶的凝固作用也很大，可以放到37度温箱，半小时就凝固得很好。
非常同意～～！
TEMED不能污染了，要注意。
ii077345 (2014-3-23 22:30:26)

请问各位前辈：
1. 我的胶也是凝得很慢，前后加起来时间总要2h，分离胶与浓缩胶间的界面成小波浪状；
我是严格按配方按顺序加的，10%APS也都是每次新配的，TEMED以两倍的量加，而且是在室温28度的环境里面。
分离胶tris，pH8.8
浓缩胶tris，pH6.8
10%SDS，pH7.2
以上三样都是一月前配的，请前辈们帮忙看看问题出在哪里？万分感谢！
2. 加入梳子后，凝胶过程中总是在最后几个梳孔因为气泡聚集导致不能利用，这个是因为什么原因，有什么办法防止？
3. 还有，最后曝光出来发现条带不在同一直线上，这是不是胶的缘故？
求解答，谢谢！