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【求助】关于失败的两次WB......
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第一次做发现二抗过期了，根本无法跟显色底物反应。
第二次做买了新的二抗，应该是能成功的啊。居然还是不行。转膜是转上去了的，可是加了显色底物后硝酸纤维素薄膜上还是很干净，白白的一片，一点发黄的痕迹都没有。那是什么原因啊？难道是一抗根本就没结合上去，导致二抗也无法结合就不能显色了吗？一抗买来一年多了，放在那就一直没用过。这次拿出来发现一抗在管子里都变固体了。不知道是否是因为曾经把一抗放—80度两个月对抗体有影响么？大家有见过抗体放冰箱里变固体的么？应该是液体的才对么？还有显色后一点本底都看不到又会是什么原因呢？Cry
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最新回复
kewanqi2011 (2014-3-23 23:08:18)
丁香@@ (2014-3-23 23:08:40)
不知道是不是温度太低对抗体活性有影响。。。。。。有人能帮忙解答下么？
windboy (2014-3-23 23:08:57)
应该还是一抗的原因.
或者有没有先排除显色剂的问题.
079777chao (2014-3-23 23:09:15)
我们的一抗放在-20度有十来年了，一直很好用
二抗过期也有三年了，至今还在顽强地工作着……当然我们那个是ECL，不是显色的
不过看来不是抗体的问题
nn255 (2014-3-23 23:09:34)
hyuu (2014-3-23 23:09:52)
1、一抗的保存时间和温度要看说明书，不同厂家的不一样的，象santa的是要求放4度的，有的公司是放-20度的。要不先作考马斯亮蓝染色确定蛋白未降解 ，再做斑点杂交检测一抗效率；
2、显色剂有没有问题，可以单用ECL加一点点二抗，看有没有荧光，分析是否是这二者问题；
3、如果是DAB显色，可能和表达量低有关；ECL和温度有关，冬天曝光时间应延长；
4、目的蛋白的大小，转膜时间要注意。强烈建议转膜后用考马斯亮蓝染胶，分析转膜效率。
丁香@@ (2014-3-23 23:11:25)
转膜以后用丽春红染了色看，蛋白确定被转上去了的，效率也挺高的，就是后面显色没东西。也做了个阳性的对照，怎么样阳性的条带也应该有的啊。呜呜呜
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