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【求助】IEF时电压上不去

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-23 23:47    作者: koook5695    来源: 分析测试百科网

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【求助】IEF时电压上不去

仪器：GE的IPGphor
样品：原始蛋白样品和沉淀除盐样品
现象：
最初用原始样品跑了7cm胶条，设置电压4000V，可实际只能达到1500左右，跑了24个小时以上，总的VHrs也不够，后又多跑了一会；最终SDSPAGE染色，还能分辨点的分布。
分析及咨询技术支持后经除盐处理样品，同样条件，仍然出现同样问题，没有多跑，机子按设置停止（总的VHrs仍不够，为什么会停？）最终SDSPAGE染色，基本上看不到明确的点（都是横纹）。
再次咨询技术支持，经他们建议测试机子无明显故障，说7cm胶条电压不容易上去，改用18cm胶条，同时两个样品电泳，仍然出现上述问题：设置电压8000V，只能到4000左右。
问题
1。此种问题是何原因？如何解决？
2。IEF时未达到设置的VHrs，机器为何会走向下一步和停止？
Tips：
1。同样地原始样品（未除盐的）在1个月前曾经试过，一切正常。
2。所用溶液没有变化，遵循一个protocol。
3。今日偶然发现，运行中（当然要暂停）取下一个胶，电压立即到8000V（此时机器protocol仍是strip为2）。当更改protocol的strip为1（只有1个胶槽），电压就降下来了；或者不更改protocol，放回另一个胶槽（同时运行1个2胶槽）电压也降下来了。
4，电流每次都可达较高水平（50uA）
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最新回复

  • feima+ (2014-3-23 23:48:04)


    推荐两个方法：
    1、延长低压时间除盐
    2、中间换滤纸
    具体原因看这个帖子
    cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=10443526&sty=1&tpg=1&age=0')

  • koook5695 (2014-3-23 23:48:23)


    谢谢
    好像那个帖子也没有说明原因和解决办法啊!
    样品我们已经除盐处理过了（1个月前曾经试过除盐的样品，一切还正常）。现在我们除盐时间2个小时以上，最长一次5个小时呢

  • sunnyB (2014-3-23 23:48:42)


    我用的17cm胶条，遇到同样的问题。低压长时除盐效果也不好，经丙酮沉淀后，刚才观察，电压仍不能达到良好效果，我想也许是不是核酸在作怪，你有没有用核酸酶处理？在者，你上样量是多少，是不是加大上样量可以增加蛋白点数，我曾加倍上样量，点会比原来多很多。

  • koook5695 (2014-3-23 23:49:03)

    没有加核酸酶，但经过超声了，应该不是核酸的影响

  • ending (2014-3-23 23:49:20)


    提几点建议供参考：
    1。彻底清洁IEF的电极板
    2。检查你的每一个胶条槽
    3。重配水化液，特别注意一下IPG buffer的质量，有没有过期。

  • rxcc33 (2014-3-23 23:49:36)


    IPG buffer过期不久的话基本上没有关系的，我们用的胶条，buffer还有一些其他的东西基本上都过期了，跑起来还可以。

  • bluelake (2014-3-23 23:50:07)


    电压上不去一般是盐离子浓度过高，因为跑第一向时为防止烧坏胶条等一般会限制电流，当你离子浓度过高，电压就会上不去。你试试降低ipg buffer浓度，0.5%其实已经足够。要不就是你样品提取的问题了
    至于你的第三点疑问，答案很简单：因为每根胶条限流50uA，两个加起来就是100uA，拿掉一根当然电压能够加倍

  • koook5695 (2014-3-23 23:51:30)

    谢谢大家的建议，
    试剂应该没有问题，因为使用别人剩下的（最近还在做）
    胶条槽已经彻底清洗
    换过两次水化液了
    IPGbuffer目前浓度为0.2%
    ---现在刚重新配完水化液，明天重新提取蛋白---
    看看吧，不行就搭盐桥，有点怕地说~~~

  • koook5695 (2014-3-23 23:53:06)

    各种方法都试了，效果是越来越差，不知道怎么做下去~~
    1。更改样品制备方法--减少能舍弃的操作步骤，来尽可能减少引入增加干扰的因素
    2。重新配置液体，校正溶液的pH
    3。沉淀除盐
    4。盐桥
    5。延长除盐时间
    6。更换胶条
    ~~~
    大家帮我想想还有什么可以改进的？
    难道真的要买一个cleanup，不是心疼money主要是担心用了还是一样

  • 2541 (2014-3-23 23:53:24)


    上样量多大？可能上样量太大了，前一阵和你出现同样的问题，11cm的胶条电压只能到4000v,上样量240ug（银染显色，GE公司）,后来调整了上样量，改为100-120ug左右，现在一切正常了。clean up kit 可以适当的去除一些条纹，但是蛋白点也明显减少。

  • jingling845 (2014-3-23 23:53:40)


    检查一下你配重涨液所用的水吧， 我前几天刚刚出现这种情况，查了半天，连空胶槽都试了。最后发现是水的问题。

  • tuuu2 (2014-3-23 23:53:58)


    推荐建议你对方法的改进如下：
    1. 对你的样品进行TCA- 丙酮沉定(但是有可造成某一些蛋白不容解).
    2. 水化上样液的DDT量减少.两性电解质量调小.
    3、适当延长低压时间除盐
    4.必要时聚焦前更换盐桥.
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