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【求助】蛋白为何表达不出来?

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-25 13:04    作者: xyw5    来源: 分析测试百科网

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【求助】蛋白为何表达不出来?

最近表达一个基因的蛋白, 是原核表达, 全长是近2000bp，使用的是DH5 alfa菌.
一连换了三种载体，HIS标签的pET系列的一种，GST标签的pGEX系列的一种，热诱导的pBV220载体，载体构建应该没什么问题，都测过序。
诱导空载体都能看见相应标签的表达，构建的载体都没看到相应大小自己的蛋白。
请高手们分析分析这是什么原因？大家遇到过这种情况吗？
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  • 12xunmei (2014-3-25 13:04:33)

    没有明白为什么要用DH5 alfa表达蛋白，这只不过是个表达质粒的菌株能表达蛋白马？当然不能。。
    表达蛋白应该有不同的质粒在对应不同的菌株表达才对吧，我表达HIS标签用BL21（DE3）很好表达阿，你是没有说清楚还是就是用DH5 alfa表达的啊?如果是赶紧换呵呵

  • xyw5 (2014-3-25 13:05:54)

    菌的影响很大吗？看过其他的文章，好像也有好多人用DH5 alfa的啊。

  • 12xunmei (2014-3-25 13:06:18)


    是吗菌影响大了，我没有见过用DH5 alfa表达国蛋白的我也觉得不可以，如果有文章的话呵呵，给我我可要看看了，你换表达菌株吧肯定会好的了。

  • xyw5 (2014-3-25 13:06:37)

    好的，我这两天也在准备换个菌种试一试呢。非常感谢。
    那为什么空载体的标签蛋白可以在DH5 alfa菌里诱导表达的很好呢？

  • uaubc (2014-3-25 13:07:02)


    这种情况应该分析你的基因序列是否含有稀有密码子（或碱性氨基酸）；特别是N端的稀有密码子情况，搜索本论坛，就可知道
    如果已有报道其抗原性区段位于那个区域，或者用软件预测其抗原性区段，只克隆表达其抗原性区。

  • xyw5 (2014-3-25 13:07:51)

    我不是做抗体的，暂时希望表达出其全长蛋白，因为不知道其功能区，所以也不能分段表达。有人建议我先做WESTERN BLOT，或许是因为其表达量太低，SDS-PAGE有可能看不出来。所以我想先尝试一下WESTERN 检测是否有表达。
    不知道大家碰到过表达量比较低，SDS-PAGE看不出来的蛋白表达情况没有？

  • tuuu2 (2014-3-25 13:08:16)


    我最近在做真核表达，也表达不出我的蛋白。不明白是怎么回事。是转染效率低还是蛋白根本不表达。

  • xyw5 (2014-3-25 13:08:33)


    DH5alpha 一般用于质粒保存，表达质粒需要特定的缺陷型的菌种 JM109(DE3) or BL21(DE3)可以用于蛋白表达

  • qianqin1977 (2014-3-25 13:09:01)


    DH5alpha不太可能是不表达的因素，我们从各种文献也可以发现一些人还是热衷于使用DH5alpha而不是BL21来表达某些蛋白。我觉得主要原因可能归因于你的目的基因序列太长或者序列中含有一些稀有密码子。从胶上对比表达后的空载，不知道你能不能发现重组菌的泳道上是否有多出来的条带（尽管这些条带可能比理想的分子量要低），这也许能说明你的目的蛋白没有表达完全？Westernblot检测也很有必要，一方面可以检测出是否表达量太低，一方面可以检测出目的蛋白表达是否完全。

  • 12xunmei (2014-3-25 13:09:21)


    2000bp, 700个amino acid，近80kDa，就算用BL21表达都够呛，即使能表达，估计也得用western了，还用 DH5alpha，呵呵，能表达就和买彩票差不多了。
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