【求助】】12.5kd分子量蛋白western一个月了什么结果也没有

最新回复

• leifengta (2014-3-25 21:20:32)

  
  不说你背景高的原因，0.45um的膜做12kD的蛋白很难，20以下的得用0.22的膜，膜孔径太大都转过去了。

• njkph (2014-3-25 21:21:06)

  
  你可以先跑一下胶 染一下胶看一看你的位置处有没有你所要的条带

• ffaa (2014-3-25 21:22:14)

  
  1、可以先确定你的电泳有无问题，按照楼上的说法去做：跑完电泳，用考染染色，确定电泳无问题，再进行第二步转膜。
  一般来说你的条件还可以。
  2、再确定转膜有无问题：用丽春红染色，把你转移后的膜进行染色3-5分钟，如果没问题再进行封闭。
  如果有问题：
  根本无目标蛋白带：可能是膜的位置有 问题，用两块膜去夹住电泳胶进行转膜；也可能是膜的选择或处理不当，看看文献是如何做的；也可能蛋白与胶结合太牢，转不动，用“把电泳胶再进行考染染色，看看蛋白在不在”。
  3、在有问题，就要看你的一抗质量了：
  可以用ELISA来证明：包被你的电泳样品（包不同的稀释度抗原），同样用5%脱脂牛奶封闭，进行一抗、二抗处理，最后进行显色。
  如果一和二没问题，那三一般是不会出现结果的（也许高浓度有弱阳性）。
  祝你好运！

• lyxsqs (2014-3-25 21:23:05)

  谢谢，特别是战友ffaa，谢谢！我会按照大家指教的再试试~
  我的目的蛋白分子量小，12.5KD，大家有没有做过这么小的蛋白。
  我估计电泳就很难把它跑开，大家在电泳分离小分子量蛋白方面有没有好的诀窍，望不吝赐教！谢谢！

• chuntian1983 (2014-3-25 21:23:42)

  
  这种分子量的蛋白我做过，用小孔膜，在300mA转90分钟，还是蛮好做的

• lyxsqs (2014-3-25 21:24:01)

  其他的还要注意注意什么呢
  比如电泳时配什么样的胶 电压多少 跑多久
  谢谢

• lyxsqs (2014-3-25 21:25:34)

  QUOTE:

  原帖由 chuntian1983 于 2014-3-25 21:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  这种分子量的蛋白我做过，用小孔膜，在300mA转90分钟，还是蛮好做的

  你是湿转还是半干式转膜