【求助】2D电泳新手请教高手指点，做了好多遍了

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-25 22:53 作者: 04906 来源: 分析测试百科网

做了一个半月了，每张图都有问题，开始是电压上不去，后来电压升上去胶条又化了。
第一次是用液氮研磨组织，磷酸盐缓冲液提取，TCA沉淀，沉淀用上样缓冲液溶解，很难容，上清上样，电压只升到5000V左右，但胶条没有发生异常，结果横向拖尾，是不是聚焦不完全？？
第二次，用第一次的样品做了丙酮沉淀，重新用水化液溶，离心后上样，电压还是升不到8000V，结果好像聚焦还是不完全，纵向也有拖尾了，不知何原因，请高手指点。
第三次，降低磷酸盐缓冲液的浓度，直接用丙酮沉淀，沉淀用水化液溶解（这样的改变是为了降低盐浓度，让电压升上去）300V,3h. 1000v,6h, 8000v 6h电压很正常，但是胶条有一个地方总是起包，而且酸碱两端都有溶胶现象。而且，结果很差，横向不是拖尾，而是横线，很严重，点都看不清了；横向也成了一条一条的，全都是竖纹，连续跑了三次都是这样子，二向灌胶的溶液都是新配的，用SDS检测也没有问题，请问问题在哪里呢？？？我都快郁闷死了，
第一次的图：

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04906 (2014-3-25 22:59:29)

第二次的图

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04906 (2014-3-25 23:03:02)

还有一个问题，为什么第二次的点和第一次的点看起来那么不同呢，第二次的样品是第一次的样品用丙酮沉淀后的样品，为什么点看起来更多呢？但是点虽然多，为什么看起来有些太整齐了？
feima+ (2014-3-25 23:05:07)

可试试我的方法：
细胞裂解液 8M Urea，4％CHAPS，1％DTT，2％IPG Buffer
1.配制细胞裂解液
2.准备冰盒，将细胞沉淀放入冰盒中加入100ul（10mM）PMSF
3.加入1ml细胞裂解液，吹打均匀
4.用1ml注射器反复抽吸，以剪切核酸
5.加入DNase 5ul和RNase 5ul（DNase终浓度50ug/ml，RNase储存液的浓度为10mg/ml），混和均匀，4度放置2小时
6.离心，4度，20000rpm×60min（也许时间有点长，可试试缩短一些时间）
7.取上清，分装，保存于－80度，取一管放置－20度做蛋白定量用。
feima+ (2014-3-25 23:06:49)

我做的是体外培养细胞的，组织的可能是PMSF和细胞裂解液加在一起，然后研磨，我不太确定，你可以试试
vtongli (2014-3-25 23:07:06)

谢谢，我想用磷酸盐可能是对IEF有影响，所以我打算用你说的裂解液试试，PMSF是什么作用呢？不加可不可以，好像没有。
feima+ (2014-3-25 23:09:47)

PMSF是蛋白酶抑制剂的一种，可以换用其他的蛋白酶抑制剂
mogu (2014-3-25 23:10:13)

你好，我是刚加入的，也是刚开始做双向，我做的是体外培养的大鼠系膜细胞，做了几次电流都下不来，都49，电压上到5000左右，用的是伯乐的仪器，是裂解液又问题吗？
greenbee (2014-3-25 23:10:49)

你好，我是刚加入的，也是刚开始做双向，我做的是体外培养的大鼠系膜细胞，做了几次电流都下不来，都49，电压上到5000左右，用的是伯乐的仪器，是裂解液又问题吗？

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提蛋白时，尽量不要用TCA或Acetone沉淀。丙酮挥发的不完全，就会导致向你第二章图一样的模糊状的点。但挥发太干了，又不利于蛋白重溶。
建议体总蛋白时，选择新鲜样本，超声除核酸后，低速离心去除组织碎片后即可。
greenbee (2014-3-25 23:17:02)

电流高而电压不高，这说明：
1．体系中离子浓度高，检查一下，你在提蛋白时是否引入了较多的强离子溶液，如SDS浓度高，或其他盐离子浓度高。
2．换质量比较好的两性离子去污剂。detergent的质量不好，会影响蛋白质在等电点附近的溶解度，发生沉积，导致电流高而电压上不去。
3．定期彻底清洁你的IEF金属板。有时，IEF金属板上会残留一些覆盖油或其他液体，一定要擦干净，最好定期用胶条槽的洗液清洗一遍。
feima+ (2014-3-25 23:17:23)

彻底清洁你的IEF金属板，要擦干净，金属部分可用酒精擦拭，晾干了再用
zhezhe (2014-3-25 23:21:59)

TCA 没有洗干净,TCA为酸性,要用丙酮至少4次以上
04906 (2014-3-25 23:22:23)

其实我的只是改变了提取条件，用tris替代了原来的磷酸盐，去掉了TCA丙酮沉淀等过程。其他都没有变。看来主要是盐离子和TCA有影响
caihong (2014-3-25 23:32:16)

用tris替代了原来的磷酸盐，仍然可以采用10％TCA－丙酮沉淀等过程，但是在洗的过程中要把TCA 尽可能的洗去。