【求助】请教SDS-PAGE胶蛋白条带上粗下细和PVDF膜的问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-26 15:57 作者: www.1 来源: 分析测试百科网

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【求助】请教SDS-PAGE胶蛋白条带上粗下细和PVDF膜的问题

在做western blot时遇到两个问题，向高手请教解决方法：
1. SDS-PAGE胶蛋白电泳后，部分条带上下粗细不均，出现上粗下细的现象，见下图箭头所指。
2. 转膜后，PVDF膜上出现大量象食盐一样的细小颗粒（决非气泡），照片照得不是太好，显得颗粒过大，实际上就象一颗一颗的细盐颗粒密集分布。
不知大家如何解决这两个问题的，谢谢！

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www.1 (2014-3-26 15:58:17)

第二张图

26360433.jpg
wmp1234 (2014-3-26 15:59:33)

1，首先得保证你的胶凝固的彻底，否则容易出现条带歪斜。
2，你的PVDF膜是否用甲醇处理得当，不能浸的太久。
www.1 (2014-3-26 15:59:52)

1.我用的胶是Invitrogen公司直接买的成品胶（NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well），应该不是胶的问题
2. 甲醇处理PVDF 膜一般不能超过多长时间呢？
summerxx (2014-3-26 16:03:13)

1.PVDF膜转完蛋白后不应该看到条带的，白白的什么都没有，丽春红染色后条带都不是很明显，而你的PVDF膜上那么清晰的条带，不应该的。2.是不是你的蛋白浓度太大了，一块胶也有最大上样量限制的。3.还有一种可能，你的蛋白纯度有问题，有非蛋白以外的物质，如离子、脂等。4.自己配块胶试试，排除胶的问题，因为从你的图上看，就那两道跑的有问题其余都还好，所以不是胶的问题就是样品的问题，自己排除下。5.甲醇处理不同的膜应该要求不同，自己查下，说明书上都有的，amersham的我们做不超过20s。
www.1 (2014-3-26 16:03:36)

为了结果好点，我确实把蛋白量加大了些，但不好解释的是：我用同样的样本、同样的膜、但更大的蛋白量做第一次预实验时却得到了很好的结果。上面这种不正常的结果是后来又重复3遍才出现的。我开始担心电泳缓冲液、转膜缓冲液不新鲜，但我重新换成新鲜的后，结果依旧。
除了考虑甲醇处理PVDF膜的时间，我觉得是不是还要考虑转膜条件，我用的是120v,1.5h，这个电压是不是太高了呢？
www.1 (2014-3-26 16:04:01)

你第一次的结果我不好说，但是从你现在的结果看是电泳的问题都没有解决好，拿到好的稳定的电泳结果再来考虑转膜的问题，其实考兰的检测线很低的，几十ng都能检测出来。还有就是你样品的杂质问题。以前我跑电泳的时候有几次加错了上样缓冲液，里面含有大量铜离子，电泳结果就是歪歪扭扭的。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=10521738&sty=1&tpg=1&age=0')
是对电泳结果不正常的分析，看看对你做好电泳有没帮助。
eric930 (2014-3-26 16:11:05)

我们转膜 50V-60V 1.5h
eric930 (2014-3-26 16:11:23)

1.可能你的上样量太大了，
2.我们转模70V，1hr。