【求助】请问一个蛋白表达的问题

最新回复

• 831226 (2014-3-27 11:43:15)

  你的这个问题恐怕很难解决，你所表述的条件极其模糊！蛋白表达是一个相当复杂的问题，建议你把问题说明清楚详细。提供几点供参考：
  1、表达载体？克隆的位置？与rbs的位置关系？
  2、表达宿主，真核还是原核？
  3、准备选择的表达条件？
  4、序列的密码子与表达宿主的密码子偏好关系等？
  5、表达的目的等？

• ququer787 (2014-3-27 11:43:42)

  各位老师您们好！我将我所表达的条件及相关信息提供如下，请老师们帮帮我的忙！
  1、表达载体：PET-22b
  2、您说的克隆位置，及与rbs的位置关系是指什么？我刚刚搞分子生物学不太懂，请教一下。
  3、表达宿主为E.coli BL21
  4、准备选择的表达条件：IPTG浓度为1mmol/L 表达温度为37℃，表达时间需要研究确定。
  5、具有起始密码子和终止密码子，即
  ATGGGCTACAAGACCCACAAGGGGAAGACCGTCCGGGACAAGGACGGCGT
  ACCAATCCTGATCGGTGAACCTGTTCTGGAGCGGGATGAGTTCGACGTTC
  TTCAAGAGGTGTTGAACAGTCGGACGCCGCACCGTGCCAGGCGCAGGAAG
  GACACGAAGTCGCTGTTGTTGCAGGTGGCTATTTGTGAGGGGTCCAACAC
  CCGCATGTACAAGGCCCCCCGGTCCGGGTCGCCGCTCAGCGACTACAACT
  GTCGGGCGGCGGCCGCTGGTGTCCGATGCCCGTCCCCGGCGGGTATCCGG
  GCGGACTGGCTGGAGGAGTACGCGGAGCGGGAGTTCCTGGCCTTGGTGGG
  GCCGGCACGGATGACGAAGACGATCAAGCACAAGGGGTATGACCCGGGGC
  CGGAGCTGGCGGAGGTCACCCGGGAACTTCGGGAGCTGTACAAGGAAAAG
  GACGCCCGGAGGTCTCGGACCGGCCGCATGATCTGGCAGGAGGAAGTAGA
  CGCACTGGAGCGCCGTGCGGCCACGCTGGAGGCCACGCCGAAGGTGGAGG
  CCCGCACTGAGGTCATCGAGACTGAAGAAACGTTTGCCCAGCACTGGCGA
  AGCCTGGGCCCAGCAATTCCCATGTCCAAGGTCAAGACGGGAGAGTTGCT
  GTTGGAAAAACCGGTCGTGCCGGAGTCCCTGGAGGGAATGAGCGAGGCGG
  ACGTGGCGGACCTTCAGGCTGACGTCCGGGCCTGGGAGACGTACGACGAA
  GCGCACCGCGAGGCGATAGCCGAACGTCGCCAGGTGCTCATAGATGCTGG
  GGTCAAGATTTACGTGAGCAAGGGGGAGTCCGGGGGCGACAAGCGCGACC
  CACAGATGGATGAAAGCCGTGTGCGGTTTGTCATTGAACGGGGCGACCCG
  ACGGCGGACGTGATCCTGTACGACGCACAGGATTGA
  表达宿主的密码子怎么分析啊？
  6、表达的目的是想表达后经过电泳和活性测定等手段检测此基因是否具有产生我所需要的物质的能力。
  请各位老师不吝赐教！

• fsdd817 (2014-3-27 11:46:12)

  各位老师您们好！我将我所表达的条件及相关信息提供如下，请老师们帮帮我的忙！
  1、表达载体：PET-22b
  2、您说的克隆位置，及与rbs的位置关系是指什么？我刚刚搞分子生物学不太懂，请教一下。
  3、表达宿主为E.coli BL21
  4、准备选择的表达条件：IPTG浓度为1mmol/L 表达温度为37℃，表达时间需要研究确定。
  5、具有起始密码子和终止密码子，即
  ATGGGCTACAAGACCCACAAGGGGAAGACCGTCCGGGACAAGGACGGCGT
  ACCAATCCTGATCGGTGAACCTGTTCTGGAGCGGGATGAGTTCGACGTTC
  TTCAAGAGGTGTTGAACAGTCGGACGCCGCACCGTGCCAGGCGCAGGAAG
  GACACGAAGTCGCTGTTGTTGCAGGTGGCTATTTGTGAGGGGTCCAACAC
  CCGCATGTACAAGGCCCCCCGGTCCGGGTCGCCGCTCAGCGACTACAACT
  GTCGGGCGGCGGCCGCTGGTGTCCGATGCCCGTCCCCGGCGGGTATCCGG
  GCGGACTGGCTGGAGGAGTACGCGGAGCGGGAGTTCCTGGCCTTGGTGGG
  GCCGGCACGGATGACGAAGACGATCAAGCACAAGGGGTATGACCCGGGGC
  CGGAGCTGGCGGAGGTCACCCGGGAACTTCGGGAGCTGTACAAGGAAAAG
  GACGCCCGGAGGTCTCGGACCGGCCGCATGATCTGGCAGGAGGAAGTAGA
  CGCACTGGAGCGCCGTGCGGCCACGCTGGAGGCCACGCCGAAGGTGGAGG
  CCCGCACTGAGGTCATCGAGACTGAAGAAACGTTTGCCCAGCACTGGCGA
  AGCCTGGGCCCAGCAATTCCCATGTCCAAGGTCAAGACGGGAGAGTTGCT
  GTTGGAAAAACCGGTCGTGCCGGAGTCCCTGGAGGGAATGAGCGAGGCGG
  ACGTGGCGGACCTTCAGGCTGACGTCCGGGCCTGGGAGACGTACGACGAA
  GCGCACCGCGAGGCGATAGCCGAACGTCGCCAGGTGCTCATAGATGCTGG
  GGTCAAGATTTACGTGAGCAAGGGGGAGTCCGGGGGCGACAAGCGCGACC
  CACAGATGGATGAAAGCCGTGTGCGGTTTGTCATTGAACGGGGCGACCCG
  ACGGCGGACGTGATCCTGTACGACGCACAGGATTGA
  表达宿主的密码子怎么分析啊？
  6、表达的目的是想表达后经过电泳和活性测定等手段检测此基因是否具有产生我所需要的物质的能力。
  请各位老师不吝赐教！
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  1，3，4，5没问题，
  2，rbs距离，因为你用的就是表达载体，这个也不是问题，确保你克隆的时候是in frame就OK
  密码子分析，就是看看有没有E.coli中的稀有密码子（rare codon）。园子里搜索，会有一把一把的结果
  6，表达目的，是一个酶对吧。原始物种和E.coli的同源性怎么样？如果太远，有活性的可能性会低些。不过你始终是要用活性鉴定的，这个基本无法预测，要实验才知道。

• fsdd817 (2014-3-27 11:46:29)

  
  原物种为链霉菌，这对表达有影响吗？另外，我的东西不表达有人说是因为我的序列有问题，各位帮帮忙是我的序列有问题吗？还有就是我是通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测的，就是把收集菌体后把菌体和电泳上样缓冲液混合，沸水浴１０分钟，然后离心取上清也点样．发酵液上清液也同样制备样品点样，电泳，这个检测的方法没问题吧？请各位帮帮忙！谢了！

• glass (2014-3-27 12:45:13)

  
  各位老师大家好，请问细菌周腔蛋白的提取方法！

• ququer787 (2014-3-27 12:45:35)

  
  我还是没有诱导出来，怎么办呀？急死了！

• yychen (2014-3-27 12:45:58)

  
  要不换个表达菌试试吧,我之前就是用BL21表达了两个月不出来东西,换了个菌,就表达出来了,别着急,多想想办法,肯定能出来的,好运!

• ququer787 (2014-3-27 12:46:17)

  
  换什么菌呀？除了BL21（DE3）以外，我也不知道换什么了？我们领导说不是菌的事，是我的序列有问题。哪为高手能帮我分析一下序列呀？

• 小野花 (2014-3-27 12:48:52)

  
  我的那个菌是一个在公司的师兄给的,具体叫什么,是什么菌,我也不知道,是人家公司的秘密,但肯定不是BL21（DE3）.
  至于序列,我表达不出来时也怀疑过,但分析来分析去,都是正确的.
  而且,加IPTG的时机也特别重要的,你得把握好才行>

• xyw5 (2014-3-27 12:49:11)

  
  随便换什么菌都行，只要这个菌不表达和你要的蛋白非常相近的东西。当然helper plasmid还是要的。比如可以用pT7pol26来代替在BL21里的那个DE3. 我用的菌是ＭＧ1655，一种wildtype的大肠杆菌。

• wmp1234 (2014-3-27 12:49:33)

  
  我就是不知道怎么分析序列，你是怎么分析的呀？我原来做的时候都是老师分析的，所以到现在还不知道怎么分析，什么样的序列才是能够正确的序列．帮帮我的忙行吗？