【求助】包涵体溶解不了!

最新回复

• 66+77 (2014-3-27 16:12:39)

  
  感觉好像回答过似的啊。你可以把尿素或者盐酸胍浓度加大，尿素可以到10，盐酸胍可以到8，过柱子当然要把所有的Buffer 都加变性剂啊。包涵体过柱子之前最好用洗涤液处理一下，洗干净的包涵体再过柱子。洗得时候用低功率的超声超一下最好。
  祝你成功

• boom (2014-3-27 16:13:06)

  
  谢谢了,对了,我的蛋白是重组蛋白,而且还含有二硫键,那么也就是不溶解可能与没加DTT, -ME之类的还原剂有关,但如果加上这些还原剂之后还不能直接过柱子,得把还原剂透析掉才能过柱子,所以我在忧郁到底加还是不加!
  请大家指教啊!

• 66+77 (2014-3-27 16:13:25)

  
  我的也有二硫键，而且是4个呢，都融了啊。我也没加还原剂。你再试试吧。试验就要抱着试试的态度，要不怎么叫试验啊

• wmp1234 (2014-3-27 16:13:44)

  
  如果有还原剂如DTT或者b ME，肯定不能直接上Ni柱。挂不上的。
  我也有一个蛋白很难溶。8 M Urea溶不了，用9M还不行，加Triton X-100到2 % ,37 度水浴超声半小时才能溶解。
  以前 在一个帖子中提过一点：溶解包涵体的一个小诀窍：
  先用水（或者buffer）将包涵体重悬成细微颗粒（有条件可以用小匀浆器），然后再加入高浓度Urea或则GuHCl到目的浓度。这样会快很多。
  Good Luck

• boom (2014-3-27 16:14:09)

  
  对了，今天我用binding buffer 配了含１０Ｍ尿素的溶解液，但此溶解液放到４度会很快又将尿素析出．如果我拿此溶解液溶解包含体，溶解后上清是不是就不能放到４度冰箱呢？如果溶解了，那我怎么在低温条件下过ＮＩ柱呢？

• 66+77 (2014-3-27 16:14:26)

  为什么要低温纯化啊？我不明白？我纯化就是室温纯化的。

• boom (2014-3-27 16:14:47)

  
  我们实验室过NI柱时都是低温,好象是为了防止蛋白被讲解吧

• 66+77 (2014-3-27 16:15:28)

  
  你可以像缓冲液加入蛋白酶抑制剂啊。你的包涵体在过柱之前有没有处理过？最好洗一下，这样可以把包涵体表面的杂蛋白处理掉。

• boom (2014-3-27 16:15:46)

  
  洗过的,我今天是拿10M尿素重悬后,超声,之后又放到45度水水浴了,下午1点半放进去的,我打算过夜,明天再跑样,如果还没溶解,我真没办法了

• xyw5 (2014-3-27 16:16:07)

  制备的包涵体要新鲜的好融，过夜或保存后的要溶解，要得溶解液就要多了，而且要难容些

• boom (2014-3-27 16:16:26)

  
  谢谢了，我就是拿新鲜的做的，今天我拿１０Ｍ尿素，加热到６０度，感觉溶了百分之７０－８０，但我现在怕蛋白被尿素修饰了，发生不可逆变性就惨了，因为我纯化后要复性的，大家发表发表建议帮帮我啊！

• 小野花 (2014-3-27 16:16:49)

  
  最好先把包涵体洗干净再加bindingbuffer。我看GE的柱子的说明书上bindingbuffer是8M的尿素，估计因该包涵体都能溶解。我纯化的一种蛋白也是用bindingbuffer溶后，还是发现了很多沉淀，室温搅拌了很久，还是有一点。
  我忽略了。但是过柱后跑胶我的目的蛋白能纯化到。溶不完估计只会影响蛋白的量吧？不会影响质。
  顺便向大家请教下：怎么知道蛋白含有多少二硫键？是不是有一个预测的软件？谢谢了！！

• tuuu2 (2014-3-27 16:17:12)

  今天过NI柱了，但什么都 没有，但昨天刚溶解后还测了OD值的（有），难道在室温放一晚蛋白全没了 ？晕！
  好像看蛋白有多少二硫键，是有预测软件，可以查查有相关的 网站，把你的蛋白序列一提交，就会有结果了 ！

• nut6694 (2014-3-27 16:17:29)

  
  你可以用6M尿素在16度下溶解2.5 小时.然后离心11000转30分钟.在沉淀中在加8M尿素再溶一个小时.去除 包涵体的过程中PH值很重要的.

• boom (2014-3-27 16:17:48)

  那用8M尿素溶解时需要多少温度呢？需不需要搅拌呢？