【求助】western 求助

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• redbutterfly (2014-3-28 09:59:48)

  
  首先，上样量不是指上样体积，我们这边有人提过蛋白浓度非常非常稀，这样就算加再多，蛋白绝对含量也未改善啊。
  实验出问题的可能性比较小，我觉得是不是抗体的问题，请问是什么公司的抗体啊？不会是国产分装的抗体吧，效价被稀释了很多？
  为什么不继续试试1：50，我觉得你的一抗二抗都比我用的多多了，所以严重怀疑抗体，呵呵

• she (2014-3-28 10:05:01)

  
  谢谢，我提的蛋白浓度大约是18ug/ul。抗体我也不知道是哪个公司的 因为我是新手，嘿嘿，说明书上有alomone labs字样。但是绝对不是国产的。
  你的意思是不应该是别的条件比如电泳，转膜的条件不合适造成的是吗？
  还有就是我跑电泳时候溴芬蓝总是很厚，为什么压不成一条又细又直的线呢？这个对实验结果有影响吗？

• redbutterfly (2014-3-28 10:05:23)

  
  有没有漏打小数点啊，18ug/ul也太浓了点吧，如果这个浓度的话，那你20ul的上样体积足足就有360ug了啊！！！
  我是觉得你的内参既然能做出来，那么技术方面就应该没有太大的问题，比如电泳转膜等。
  怎么会不知道抗体是哪个公司的呢？是实验室遗留下来的？这样的抗体出问题的几率比较大哦。
  溴芬蓝很厚可能是你的loading buffer加的太多了（如果你是2*loading buffer那也得有20ul了），不行你改成5*的试试，或者换溴芬兰比较稀的loading buffer吧。我用的是按照分子克隆配的2*loading buffer，比较淡，溴芬兰浓度刚好合适。
  补充一句，我wb做的也不多，有不对的多指正啊

• taoshengyijiu (2014-3-28 10:05:49)

  
  蛋白浓度大约是18ug/ul（蛋白加上样缓冲液总体积上过40微升）
  意思是你每孔加样总量为720ug/well哟？上样量好大哟！一般在10ug/well。
  1.分子量好大？你电泳上能否看到？可以先走电泳确定你的目的蛋白，再做电转。
  2.抗体稀释倍数一般在500－2000，你的稀释倍数太小。不好确定是你的抗体有问题还是其它原因。
  你还可以把你的蛋白直接点膜（量可以加大点），按照你现在的条件杂交。主要是排除你的目的蛋白在转移中是否受到影响。
  3.电泳时候溴芬蓝总是很厚，这个应该不原因，是缓冲和电压影响的。可以把上样缓冲改为4x的

• ha111 (2014-3-28 10:06:21)

  我刚开始做western，为什么内参条带很清楚，基本没有杂带，而目的条带始终没有，
  应该不是上样量的问题，因为我上的样不少了。而且我始终觉得不应该那么大的上样量（蛋白加上样缓冲液总体积上过40微升）
  转膜时间2小时，封闭1小时。
  一抗按1：200稀释不出带子，按1：100稀释可见很浅的条带。
  二抗1：500 1：1000 1：2000都试过了。
  请高手指点一下 条件应该从哪些方面改变一下呢？
  ......
  
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  1、如果内参很清晰，证明你的系统没有太大问题，至少电泳、转膜、封闭、一抗、二抗以及显色或曝光等都不应该有问题。
  2、你用的一抗和二抗比例都是够大的，我们一般一抗比例是1：500到2000，二抗比例是1：5000到100000。也许你的抗体效价不好，但你的标准品能出来而且清晰，到也可以去用。
  3、你的样品无清晰条带：是指你的样品在最终显色或曝光时结果无清晰条带。应该的原因是你的样品中无目标蛋白——具有相应免疫原性的蛋白。用WB检测，其灵敏度是很高的，如果没有条带出现，只能说明无具有相应免疫原性的蛋白。
  也许你的蛋白变性/复性没做好，也许只是分子量一样或差不多实际根本对不上。如果你的一抗是单一株的单抗那不出的机会会很大的。
  证明方法：
  1、直接点膜或用ELISA检测：证明样品中原来有无具有相应免疫原性的蛋白；
  2、电泳后直接染色：证明你的样品已经进入分离胶并被很好地分离；
  3、转膜后用丽春红染色：证明你的样品已经被转移到膜上；
  4、把你的标准品加到你的样品中去：证明你的体系不会干扰（负干扰）WB检测。

• ha111 (2014-3-28 10:06:37)

  谢谢，我提的蛋白浓度大约是18ug/ul。抗体我也不知道是哪个公司的 因为我是新手，嘿嘿，说明书上有alomone labs字样。但是绝对不是国产的。
  你的意思是不应该是别的条件比如电泳，转膜的条件不合适造成的是吗？
  还有就是我跑电泳时候溴芬蓝总是很厚，为什么压不成一条又细又直的线呢？这个对实验结果有影响吗？
  ......
  
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  你的电泳蛋白量太高了——你大约上了360ug蛋白，正常电泳上样5到20ug，就可以了。
  至于抗体是否是国产的不重要，只要能出结果就行——你的内参不是已经OK了，证明抗体（一抗或二抗）没问题，可以用。
  电泳的溴芬蓝总是很厚，如果是在分离胶中，也就是正常的，但如果在浓缩胶的时候也一直很厚，就有问题了。——在浓缩胶中，样品及溴芬蓝会随着电泳的持续逐渐变成一条细带。

• 49888 (2014-3-28 10:06:57)

  二抗和一抗的来源相符吗，目的蛋白是多大，转膜时间呢，是不是转过了还是没转上去，用丽春红染一下

• she (2014-3-28 10:07:17)

  
  把你的标准品加到你的样品中去：证明你的体系不会干扰（负干扰）WB检测，请问这句话啥意思啊？？？
  我每次都用丽春红染，因为我用的是非预染的marker，好象目的条带出的不是很清楚，甚至不能确定是不是有。考染胶在大约70KD处有几个带子。
  二抗和一抗的来源相符吗，目的蛋白是多大，转膜时间呢，是不是转过了还是没转上去，用丽春红染一下，
  要是转膜的问题，为啥内参能出来呢？

• 49888 (2014-3-28 10:07:37)

  
  你用的是恒压转还是 还是恒流转，内参的大小和目的蛋白大小不同，也许你的转膜条件适合内参不适合目的条件