【求助】请大侠帮忙分析下我的电泳条带问题吧

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-28 10:28 作者: langlang 来源: 分析测试百科网

请各位大侠帮忙看看我的电泳条带把
我用的10*loading buffer是：
625mM Tis *(pH 6.8)
20% SDS
50% Glycerol
0.3% Bromphenolau
9% Mercaploethanol
running buffer: TBS*(pH 8.0)
每个样品体积都是20ul, 所取得样品量也是20ug,其余用runing buffer补足。
沉积胶 3.9% 分离胶6%
电泳条件是：沉积胶 45v, 分离胶 80v 150mA 两个小时
电泳液都是新配的，每次使用都换新的
胶板下面的气泡特地排过，跑胶的过程中也没有发生漏液的情况，真不知道是什么原因，请大家帮忙分析下吧。
谢谢谢谢了。

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831226 (2014-3-28 10:29:33)

总的来说,封闭\抗体孵育\曝光显影应该是没有太大问题的.还是值得肯定的.
我认为可能是你灌胶过程的问题,我想在跑胶的时候应该已经看到像蚯蚓一样的指示剂条带了吧.SDS-PAGE胶聚合要充分和均匀,充分就是促聚剂的量要加足,聚合时间和温度都要合适,均匀就是促聚剂要充分混匀,不能聚合过快,导致有的区域聚合很好,有的还没有充分聚合,这样胶就不均匀.我建议:
1. 玻璃板充分洗干净,用吸水纸擦去多余水分或者烤箱烤干,做到一尘不染,这样非常严格的,我每次都会花半个小时来洗玻璃板,磨刀不误砍柴工嘛!
2. PAGE胶各个组分加入后都要混合或者摇匀,尤其是加入AP或者TEMED后一定要充分混匀.
3. 在制胶的过程中尽量保持较低的温度,室温也可以,就是怕夏天没有空调,聚合太快了啊!!有人将配好的胶放在4度,可以连续灌几十块胶呢!
此外上样缓冲液的加法可能有点问题,应该做到加入的含有上样缓冲液的样品体积和实际所含蛋白质量都要相等,可以列一个方程计算一下,最好严格按照这样加样,不然条带也可能受到影响.
glass (2014-3-28 10:29:54)

我们做western的玻璃板每次用完后就洗干净，晾干。下次用之前用酒精擦一下，很快就可以用了。分子克隆上也是这样说的。
glass (2014-3-28 10:30:15)

看图很像是胶没聚合好，有可能是玻璃板上的水没晾干就倒胶了，我有次就是这样，出来的图和楼主的一模一样。
langlang (2014-3-28 10:30:40)

玻璃板我每次都洗得很干净了，也用蒸馏水冲过，估计还是配胶的时候应该逐个摇匀的问题。
谢谢大家在休息的日子还解答我的问题。
祝大家节日愉快哦。
831226 (2014-3-28 10:31:06)

玻璃板是不是新的？
新用的玻璃板由于出厂时粘上很多油污，单纯的洗衣粉＋酒精清洗是无法完全去除的，跑出来的条带也很奇怪，最好用清洗液（强酸级）浸泡过液再用！
kuohao17 (2014-3-28 10:33:55)

请问楼主，你目前的问题解决了吗？我最近也遇到了你类似的问题，一直不知道怎么办好。
langlang (2014-3-28 10:34:36)

已经解决了,原因是使用的电泳液不合适.
现在换成Tris-Glycin(pH8.3) ,跑出来的电泳条带看上去漂亮多了.
eve_49 (2014-3-28 10:35:26)

经解决了,原因是使用的电泳液不合适.
现在换成Tris-Glycin(pH8.3) ,跑出来的电泳条带看上去漂亮多了.

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running buffer: TBS*(pH 8.0)
每个样品体积都是20ul, 所取得样品量也是20ug,其余用runing buffer补足。

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第一,你开始的时候电泳液为什么用TBS? 想请教下.
这个电泳技术现在是相当成熟了的,电泳液用TRIS-GLYCIN系统.
TBS里面有Nacl,且离子浓度高,PH也不对,主要用来洗膜,
第二,上样是更不能用电泳液补齐,除非上样缓冲液里的成分一样,(更何况你的电泳液是TBS)
langlang (2014-3-28 10:35:53)

QUOTE:
原帖由 eve_49 于 2014-3-28 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
经解决了,原因是使用的电泳液不合适.
现在换成Tris-Glycin(pH8.3) ,跑出来的电泳条带看上去漂亮多了.

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running buffer: TBS*(pH 8.0)
每个样品体积都是20ul, 所 ...
一开始我也没有做过wb，看过的资料也不多。实验室里有人说可以用TBS，我就用了，耗费了我一个多月。这个算是做实验过程中得到的教训，不能偏听偏信，还是多看资料的好。
bamboo16 (2014-3-28 14:53:48)

我开始是看了很多资料
也做出来过这样的图片
我发现是跟胶的制作和电泳有关
胶一定要匀,电泳可以泡慢点,80-100V,这样的话条带很漂亮
如果胶不匀,再小的电泳结果和你做出来的结果是一样的,我出现过这种情况2次,现在都解决了.