【求助】离子交换层析问题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-3-29 10:20 作者: orangecake 来源: 分析测试百科网

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【求助】离子交换层析问题

我的酶做离子交换层析时用的是DEAE-Sepharose fast flow，缓冲液PH值是8.5.可经层析后在穿过峰和洗脱峰中均有目的酶（均有目的酶活性），请问是什么原因，该怎么办？请各位多多指教，先谢谢啦

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最新回复

fsdd817 (2014-3-29 10:22:38)

可能原因：1 上样量太多，柱子饱和吸附了
2 pH缓冲液再降到9，是蛋白带负电荷更多，增加吸附能力
orangecake (2014-3-29 10:22:58)

再问一下，我的柱子柱体积大概为15毫升，一般上样量最多可达多少？DEAE-Sepharose fast flow所用缓冲液的PH最高能达到多少，谢谢啦，呵呵
huifeng0516 (2014-3-29 10:23:28)

QUOTE:
原帖由 orangecake 于 2014-3-29 10:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

再问一下，我的柱子柱体积大概为15毫升，一般上样量最多可达多少？DEAE-Sepharose fast flow所用缓冲液的PH最高能达到多少，谢谢啦，呵呵
每毫升DEAE-Sepharose FF 可以吸附１１０mg HSA,不同的蛋白质可能略有差别。DEAE是弱阴离子交换吸附树脂，ｐＨ最高能到９，再高的话ＤＥＡＥ不电离，就没用了。如果ｐＨ想继续升高，可以用Q Sepharose FF
orangecake (2014-3-29 10:23:48)

我的柱子中吸附了色素除不下来，再生后效果不是太好，看了园子里有的说用氯化钠洗，我也试了，只能轻微洗下点儿，不知你有什么办法吗？色素对柱子的吸附能力有影响吗，呵呵，见笑了
huifeng0516 (2014-3-29 10:24:28)

色素对柱子的吸附影响不大，你可以用１０ｍＭ　ＥＤＴＡ试一下，ＥＤＴＡ除色素的效果应该是最明显的了！还可以用１．５％triton（含５％乙酸）、8M尿素、0.5M NaOH清洗。
orangecake (2014-3-29 10:24:50)

用ＥＤＴＡ处理的时间有限制吗
xyw5 (2014-3-29 10:25:23)

很有意思的问题
1 虽然其载样量很高，但那只是针对模式蛋白而言的，对你的酶或许并不适用，所以首先考虑上样量的问题。而且，载样量是以10%流穿计算出的，不要太在意它。15ml树脂，上样量要控制好。
2 pH的影响很厉害，一般要高于PI 值1.0以上，Q是不错的选择，但如果实验室条件不是很好，也可以拿DEAE试试。实际上pH上限9.0并不意味着9.0以上不能用，只是用起来不是很好。我就经常拿CM跑4.0，一点也没问题。
3 色素是个很麻烦的问题，可以考虑一下色素的性质采用针对性的方法去洗脱。NaOH，异丙醇都可以用，时间要把握好，树脂可是很娇贵的东西
祝你顺利！
小野花 (2014-3-29 10:25:43)

各位好，
我也想问个问题，我用的也是QFF 离子交换柱。今天本打算进一步纯化我的蛋白，可是经过第一轮的binding buffer 后，根本就没有峰出现，后来又用elution buffer 洗脱，出现了很大的峰。正常情况下，我的目的蛋白会出现在第一个峰。
实在想不明白是怎么回事，难道是柱子的问题。但是上次用的时候，柱子还是很好的。