【求助】NI柱纯化，如何去除杂蛋白

最新回复

• tie8 (2014-3-29 11:04:22)

  
  不知怎样才能获得浓度比较大且比较纯的目的蛋白，下一步用来免疫兔子做抗原用。

• gogo (2014-3-29 11:04:56)

  
  我看你的图，感觉有点象是降解的感觉，杂带都在你目的蛋白的下面，你可加点蛋白酶抑制剂！操作迅速！
  超声破碎后所有的操作都在冰上操作！洗脱不需要梯度啊，你20mM咪唑洗涤后，直接用250mM洗脱就可以了啊！

• qqq111 (2014-3-29 11:05:56)

  亲和层析在蛋白纯化的过程中本来就是初步纯化，一般能够达到60％～80％的纯度，如果对蛋白纯度要求高的话，接下来还应该过离子交换柱或分子筛（脱盐柱）。
  如果实验室只有Ni柱，那就需要增大洗脱体积:
  建议采用50～100倍Ni柱体积的最适咪唑浓度的洗脱液。
  一般情况下，40～50mM的咪唑基本上可以洗去绝大部分的菌体蛋白，关键是洗脱液体积要够量，浪费一点也无所谓。

• glass (2014-3-29 11:06:58)

  刚开始做可以先摸索一下纯化的条件。比较保险的办法是运用线性梯度先做第一次实验，即咪唑浓度从最低比如10mM到最高500mM。当然为了得到更纯的目的蛋白，需要加大洗脱的体积。可以试试60个柱体积左右。以后根据经验，就可以运用梯度洗脱了。

• yjf1026 (2014-3-29 11:07:21)

  最近做Ni柱纯化His-tag的融合 ，才有咪唑梯度洗脱后效果还是不是很好。
  
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  这效果已经不错了，至少比我做的几个蛋白的效果都强。一步ni柱到这种程度要是我的话就很满足了。

• yonger (2014-3-29 11:07:43)

  
  我的蛋白连柱子都挂不上去啊
  更惨

• zhenxin (2014-3-29 11:08:02)

  
  我的蛋白能挂上,但是很容易洗脱,低浓度的一洗就掉,怎么办啊?是不是可以降低PH值?现在用7.5的,要调成多大合适呢?
  第一次纯化没经验,忘各位大侠多多指教啊.

• 969 (2014-3-29 11:10:52)

  
  我的也有像这样的杂蛋白，做了两三次，增加了洗脱液体积，但杂蛋白还是没有去掉，不知道是不是没有加蛋白酶抑制剂的原因。