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【求助】96孔板测浓度时如何做空白？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-31 21:24    作者: 二子    来源: 分析测试百科网

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【求助】96孔板测浓度时如何做空白？

我用的是蛋白质浓度测定试剂盒，方法是BF法，加标准浓度蛋白时按0、1、2、4、8、12、16、20微升加入，然后用稀释液补足20微升，随后再在其他的孔内加入20微升的样品，最后各孔加入200微升Bradford试剂，即显色。
我现在不知道有必要设置空白孔吗？如果设置的话：
1是加入20微升的稀释液后加入200微的BF试剂？这样的话不就是和0浓度的孔一样了吗？
2是只加入Bradford试剂，其他的什么都不加入吗？
我用的是伯乐的酶标仪，机器可以调空白。
谢谢帮助！
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  • ha111 (2014-3-31 21:25:35)


    没有用BF法测过，我查了一下：
    BF法：1 首选的蛋白测定方法。对尿素、b-巯基乙醇、叠氮钠等多种
    物质不受干扰。
    2 但高浓度表面活性剂会干扰结果。
    BCA法：1 不受多种包括高浓度表面活性剂在内的多种物
    质干扰，如TritonX-100，SDS等。
    2 特别适合表面活性剂处理的蛋白标本。
    其他还有线性范围 、最小检出量 、所需样本量、 检测时间 、 反应温度等的不同。
    BF法的原理：本方法基于考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595NM处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595NM的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
    BF 和BCA一样都是制定标准曲线进行浓度的测定，不需要设定空白孔。

  • 二子 (2014-3-31 21:46:41)

    测浓度的都有标准曲线，那么就是说直接就可以用测出来的数值进行绘制标准曲线而不用减去什么值了呗；
    在请教一个问题对原始数据和吸光度在伯乐的酶标仪上应该选哪个呢？有什么区别吗？

  • ha111 (2014-3-31 21:52:57)


    1，用吸光度和标准品的值在excell里做图就可以得到标准曲线，计算出公式，减不减本底都行，不减就有截距，减去了就没有了。
    2，关于酶标仪，BF的试剂盒应该有说明，BCA 的最大吸光度在562，BF就不知道了。

  • ha111 (2014-3-31 21:53:36)


    你不是说了吗，465-595NM

  • 二子 (2014-3-31 21:55:46)

    谢谢，十分感谢，因为我以前做的一直没有做空白也没有减本底，后来别人帮我做ELISA的时候留了空白孔，我就一下想起来自己做的蛋白浓度测定是不是也用留空白。并且这中空白是不是就是除了样品其余的什么都一样的加入啊？

  • ha111 (2014-3-31 21:57:55)

    没有必要留空白，它其实就是用标准蛋白做一条曲线，把你的样品在这个曲线上找个点，利用标准曲线的公式求浓度，你加空白干吗呢？求空白的浓度吗？
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