【求助】Western blotting不出结果

最新回复

• 莲花白 (2014-3-31 22:08:02)

  
  不知道你是否有你的目的蛋白的阳性对照，比如细胞表达的蛋白用其它抗体确定是可以检测到的，可以做为阳性对照，来验证Western是没有问题的。
  从你的描述来看，一抗和二抗的结合时间都比我们平常用的时间要长，而洗的时间又相对要短，因此一般会出现的问题多是比较不干净，而你的结果是什么都没有，可能的问题主要可能是一抗和二抗的问题，或者样品里的蛋白太少，检测不到。因此针对上述做阳性对照比较重要。

• hyuu (2014-3-31 22:10:23)

  是啊，我为了让目的条带出来，就是有非特异性条带也没关系。但是还是出不来，关于设置阳性对照，还是挺有道理的，我考虑考虑。
  今天又做了内参，奇怪了，这次连内参都是什么条带都没有，上次做的内参还很好，整个体系就只是变了预染Marker,是以前的Marker用完了，我们买的新预染Marker,天根公司的，会不会是Marker的分子量不准所致？追究原因中……

• xingyi08 (2014-3-31 22:10:46)

  
  用的是整块膜还是相应区域的膜呢？如是整块膜，则可排除‘Marker的分子量不准所致’的可能性，建议设置阳性对照。
  Good luck!

• tie8 (2014-3-31 22:12:19)

  不要把膜剪得太小嘛！

• jiushikeshui371 (2014-3-31 22:13:10)

  
  检查一下一抗和二抗是否相匹配！

• wu11998866 (2014-3-31 22:13:58)

  作western还是建议采用阳性对照
  证明实验可行
  有时候电泳样品的含量过低
  不容易观察到结果
  这时候就需要阳性对照

• hyuu (2014-3-31 22:16:09)

  
  谢谢大家热情分析，回复ever_cool：我的目的蛋白分子量是63KDa,用的是相应区域的是胶，根据预染Marker条带，我切的胶包括94和60条带，其中60以下多切了0.5CM，如果按照Marker，应该也够了。
  回复alcohol_ayd：一抗是山羊多克隆抗体，所以二抗用的是兔抗山羊IgG/辣根酶标记抗体，应该也没问题。
  基于以上朋友们的意见：我们打算1.把胶再切大一点，2.设置阳性对照。

• tie8 (2014-3-31 22:16:29)

  
  我也碰到这样的问题，如果内参出来，目的不出来的话，可以考虑，把用到牛奶的地方全部改用BSA，包括封闭和二抗稀释液，然后根据背景再调整是使用BSA还是牛奶。感觉牛奶还不能算是万能的封闭剂，做有些蛋白封闭得很好，有些蛋白不行，还有些好像把目的蛋白也封闭掉了~
  还有个前提，就是目的蛋白没有被你切掉~
  个人意见~

• hyuu (2014-3-31 22:17:58)

  
  终于找到原因了，有两个原因：1.预染蛋白Marker分子量不准，45KDa条带跑在了40与35条带之间，并且靠近35条带；切胶时偏移，2，ECL发光试剂盒出了问题，显不出色，用另一套才管用。

• yychen (2014-3-31 22:20:36)

  
  有点建议 或是问题，
  和你的不同 ，就是我封闭的时间可以4度过夜，
  加入一抗和二抗的时间在1-2小时
  还有就是 用TBST洗5min*3次洗过之后，再用TBS洗一次。