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【求助】western-blotting非特异性条带多

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-31 22:32    作者: 寻梅    来源: 分析测试百科网

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【求助】western-blotting非特异性条带多

我的WB图有非特异性条带,大家分析一下哈(有图片)
我用的PVDF膜
步鲰是
1.转膜后用水洗两次
2.含0.05%土温的PBS10分钟,3.3%脱脂奶粉封闭2小时水洗两次
4.一抗PBS-milk4度过夜
5.水洗两次
6.二抗PBS-milk,室温1.5小时
7.水洗两次
8.含0.05%土温的PBS3-5分钟
9.水洗4到5次
10.DAB显色
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最新回复

  • 寻梅 (2014-3-31 22:34:44)

    我的一抗是兔多克窿抗体

  • lorri (2014-3-31 22:36:01)


    多克隆抗体做WB时一抗的浓度很重要啊，没有讲；一般洗膜用TBS或TBST，不知道你用水洗是说明书上写的吗？特异性条带多，那哪一条是你的目的条带呢？

  • 寻梅 (2014-3-31 22:40:27)


    实验步骤都是一抗说明书上的,一抗是upstate公司的，他说明书上说用尼龙摸，我用的ＰＶＤＦ膜，那条浓的是我的目的蛋白！

  • 寻梅 (2014-3-31 22:49:01)


    一抗的浓度是说明书上的最底浓度了哈

  • dmg (2014-3-31 22:50:31)


    既然最粗的那条是你的目的条带就好办啊，降低抗体浓度或者减少上样量应该可以得到漂漂结果！

  • tudou85 (2014-3-31 22:51:54)


    PVDF膜很容易出现非特异条带的
    建议使用NC膜试一下
    我的经验是NC膜背景很干净的样品拿来用PVDF膜做
    会出现很高的背景的
    而且NC膜又比较便宜
    为什么不用呢

  • hustwb (2014-3-31 22:52:16)

    土温20可提高到0.1%。

  • 12xunmei (2014-3-31 22:53:19)


    可能的两个原因：
    1。 一抗的浓度过多
    2。 一抗标记时间过长
    建议：
    可以将以抗浓度缩小，并且减少标记时间。
    多谢
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