【求助】请问，如何证明一个蛋白是膜蛋白

最新回复

• sunnyB (2014-4-01 15:46:12)

  
  既然序列已知，那这个蛋白的说明也应该有哈，难道没说这是膜蛋白？
  你这里提到“通过实验，已知一部分是表达在宿主的细胞膜上”，这是怎么鉴定的？另外我觉得如果你一定要确定蛋白是膜蛋白，是否可以用GFP融合，然后确定GFP蛋白的位置，如果GFP蛋白在细胞膜上，那也就说明你的蛋白是定位在膜上了

• yychen (2014-4-01 15:46:35)

  QUOTE:

  原帖由 sunnyB 于 2014-4-1 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  既然序列已知，那这个蛋白的说明也应该有哈，难道没说这是膜蛋白？
  你这里提到“通过实验，已知一部分是表达在宿主的细胞膜上”，这是怎么鉴定的？另外我觉得如果你一定要确定蛋白是膜蛋白，是否可以用GFP融合，然后确定GFP蛋白的位 ...

  谢谢回复。
  这个蛋白是我们实验室第一次发现的，没有同源序列，蛋白序列也是通过测序得到的，因此没有任何信息能说明它是否是膜蛋白。
  对于用GFP融合表达的方法我有一点疑问。如果通过异源表达，发现GFP蛋白表达在大肠杆菌的细胞膜上，那能否说明我的蛋白在它来源的细胞中也是表达在膜上呢？

• NBA (2014-4-01 15:46:57)

  
  膜蛋白预测，TMHMM是比较准确的，但据我个人经验（也有可能是使用不正确），对于alpha helix的膜蛋白预测较好些，但如果是beta结构，不一定能预测得到。
  MPEx是一个不错的在线预测工具，对于两种结构都比较准确。
  cuturl('http://blanco.biomol.uci.edu/mpex/')
  膜蛋白跨膜区复含疏水氨基酸，所以其实自己可以大致判断。一般可以看到疏水－亲水氨基酸的间隔排列，10个左右的氨基酸可以构成跨膜区。
  实验定位，GFP当然是一个不错的办法，
  还有就是制备抗体，分离原来物种的膜蛋白，然后电泳，western。
  当然如果有活性分析，或者有一些基本的纯化方法（比如密度离心，离子交换等）的话（只要能在胶上看到带，而且这个胶是膜蛋白部分），那么切胶再做一个质谱也是直接的证据。
  Bless

• yychen (2014-4-01 15:47:38)

  QUOTE:

  原帖由 NBA 于 2014-4-1 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  膜蛋白预测，TMHMM是比较准确的，但据我个人经验（也有可能是使用不正确），对于alpha helix的膜蛋白预测较好些，但如果是beta结构，不一定能预测得到。
  MPEx是一个不错的在线预测工具，对于两种结构都比较准确。
  cuturl('http://blanco.bio') ...

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  谢谢您的建议。
  我用多种方法做过膜蛋白预测，每次都显示有50％左右的可能是跨膜区，感觉不能说明什么问题。
  而且这个蛋白只能通过异源表达得到，我试了很多次，都没法从原始物种里得到它。
  想请教一下，如果这个蛋白异源表达时表达在细胞膜上，是不是就能说明它是个膜蛋白了啊？有没有这种理论根据啊？
  唉，这个实验已经困扰了我2年了，真是想起来就头疼啊！

• jujuba (2014-4-01 15:52:02)

  基本上是可以的，尤其是如果两个物种相隔不是很远的情况下。
  如果是异源表达了，你都可以不要用GFP了，直接高速离心分离膜，然后分离蛋白跑电泳，打质谱就OK
  其实你有了异源表达的蛋白，做个抗体，然后从原始物种的膜里面分离膜蛋白，做个wester就比较有说服力了。
  50 ％左右是什么意思？生物信息学只是预测，最终还是要实验证明的。

• 66小飞侠 (2014-4-01 16:01:40)

  
  呵呵，即使你能预测到它是一个膜蛋白，也只能说明它发挥生物学活性时可能与膜相关，并不能说明它就是膜蛋白（我的理解是镶嵌在膜上的或在其两侧的，是膜组成的一部分）所以这个方法是没办法确定它是否为膜蛋白，当然它可以作为你推理的一个依据。我觉得必须根据其功能弄清它是否具有跨膜结构域，因为有太多蛋白质可以和膜相互作用了，用大肠杆菌表达时，疏水性较强的蛋白有可能也会挂到膜上一部分，也有和膜相互作用的蛋白，比如很多大肠杆菌素（可以在膜上打孔）等，所以这个方法也是能证明的。如果你只是想证明你这个蛋白是否和来源的细胞膜相互作用那肯定是可以行的通的，你可以把你的蛋白和细胞孵育或提取后的膜蛋白孵育后检测，当然你还得提供它到膜上工作的原因了，这也就又说回到功能了，还有你的蛋白可以和表达菌的膜相互作用这既是证据之一也提示用孵育的方法做细胞成功率可能很大。所以我觉得没有必要在乎它是不是膜蛋白，首先根据蛋白功能推测其是否在膜上工作或其功能是否和与膜的相互作用相关，如果是这就是证据一了；证据二就是你的结构预测了，正如版主说的那样氨基酸分部能支持你的结构预测，还有不一定是全部的序列预测，也可以是一部分，当然你也可以把这个基因分成几部分来分别表达研究，但是这个工作量太大，可能是你们的长远计划了。如果功能和结构都能指向改蛋白的生物学活性是和膜相关的，然后再出示你的检测结果就OK了。检测方法除了我刚才说的，riboenzyme的意见也很好，但是按你描述看现在可能不能实现。如果能找到与你的蛋白相互作用蛋白还可以做敲出后看它是否还有原来的功能，这个可能会涉及到作用机制的信号通路的研究，我觉得条件不具备的话路还很长的。所以我的意见是不用太在乎它是否是膜蛋白是吧！

• kuaizige (2014-4-01 16:01:56)

  不知道你的这个蛋白来源的物种细胞方便不方便分离成单个细胞来做流式细胞术？如果可以就简单了，通过异源表达获得足够量的重组蛋白，然后免疫小鼠制备抗体，要是着急要结果就3个月全程免疫完后从尾静脉取点儿血清（多抗）做染色，阳性就说明是膜蛋白，阴性就说明不是，因为只有膜蛋白才可以直接结合抗体，呈阳性结果（如果要染色胞内分子如细胞因子还需要专门的打孔液处理细胞）。因为这个蛋白是你们首次发现的，就很值得做深入研究，单抗是一个非常有用的工具，免疫的小鼠可以进一步来制备单克隆抗体。