【求助】植物线粒体蛋白提取的问题

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• luoliqiong (2014-4-01 16:06:37)

  
  哪位楼主能够提供些提取方法或步骤？percoll是种什么分离东东？怎么操作，公司有现成的不同浓度梯度出售？　新手上路，谢谢！

• u234 (2014-4-01 16:06:55)

  
  看来楼主挺着急，希望有人帮你。我们提过动物的线粒体蛋白，通过匀浆、离心的方法，但植物就不知道了。percoll是淋巴细胞分离液，用来分离淋巴细胞。

• luoliqiong (2014-4-01 16:07:16)

  
  呵呵，是有点多！
  percoll居然是淋巴细胞分离液，用来分离淋巴细胞。 看来跟植物没有什么关系，更郁闷中！

• luoliqiong (2014-4-01 16:07:41)

  
  [转]　贴子里面cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/7905056_0.html')　
  
  请问四楼的，你提的是什么组织的线粒体，你的方法是怎样的，我们可以讨论讨论，我提小麦的，刚开始使用蔗糖密度梯度，电镜观察效果不好，改用percoll，可一直做得不理想，我是先用差速离心得到粗体线粒体，然后将粗体线粒体小心铺在18%,23%,45%percoll不连续密度梯度上，40000g离心45分钟，结果是没有在23%,45%界面上看到明显的分层，我的percoll是用0.3M甘露醇,0.1%BSA和tris-hcl PH7.5配的，明天想用连续密度梯度试试。
  不知楼主现在的实验结果如何？请教了，谢谢！

• huifeng0516 (2014-4-01 16:08:18)

  
  呵呵呵，那已经是过去时了，下面是我们提取的方法：
  成人肝组织匀浆700~750r/min，10g组织加40mL匀浆缓冲液800g离心10min，取上清，10000 g离心10 min，沉淀即为线粒体，用匀浆缓冲液洗两次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品，离心后取上清，获得线粒体总蛋白。

• luoliqiong (2014-4-01 16:08:50)

  
  非常感谢！
  再请教：匀浆缓冲液与RIPA裂解液具体是什么配方，是不是又与percoll有关？　我们想做植物线粒体总蛋白提取。

• panda王 (2014-4-01 16:11:45)

  
  呵呵，percoll纯化单核细胞和淋巴细胞效果很好，但不仅仅是淋巴细胞分离液。Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,无细胞毒性，是一种很好的梯度离心用试剂。我分离rat脑、肝和牛心肌线粒体的时候都是用的Percoll。有个小经验：由于线粒体来源（年龄、物种）和粗提试剂的不同，纯化的线粒体在Percoll剃度当中的位置是可能变化的。一般来说，粗提的线粒体经过Percoll纯化后会分成3-4层（or more），而完整的线粒体通常都是最厚最大的那一层。这一点我通过测定酶活或者电镜都已经证实了的。道理也很简单，不管粗提的线粒体成分有多复杂，一般来说完整线粒体的比重都是最大的。
  至于Nycodenz，我自己没有用过，但是作为一种新型的剃度离心载体还是收到很多好评的。其实我觉得植物线粒体的提取比动物组织困难，其主要原因在于
  1、大量纤维结构的存在使得植物线粒体更难释放，或者更容易被磨碎
  2、植物有特定的细胞内环境（PH、渗透压），需要摸索
  以下材料相信对大家有用，来自贺福初的一片文章：《线粒体蛋白质表达谱的研究进展》

• panda王 (2014-4-01 16:12:02)

  目前线粒体纯化主要是利用差速离心联合密度梯度离心方法。常用的密度梯度介质有蔗糖、Ficoll、Percoll及碘化介质(Metrizamide、Nycodenz and OptiPrep)。蔗糖由于价格便宜、溶解度高在得到广泛应用。但是, 由于高浓度蔗糖粘度大、渗透压高, 在密度梯度离心时, 经过不同浓度蔗糖梯度的线粒体,反复膨胀皱缩, 使密度梯度不能更有效的根据其大小和密度分离线粒体。Nycodenz由于密度高、粘度低、等渗、无毒、在生理pH值稳定和不抑制酶活性等优点, 在线粒体的蛋白质组学研究中得到越来越广泛的应用。OptiPrep 是Nycodenz 的二聚体, 具有短时间(约3 h)内形成自动梯度的优势。。Murayama K等[2] 介绍了一种用Nycodenz 密度梯度联合1D SDS-PAGE一步提取小鼠肝细胞各亚细胞组分的方法。Nycodenz经过反复冻融形成连续的密度梯度, 分离出52 个组分, 每个组分所含的蛋白质用细胞器特异的标志酶活性检测、标志蛋白的免疫印迹结合各细胞器的特异密度范围来确定。根据琥珀酸脱氢酶的活性测定及细胞色素氧化酶的免疫印迹, 线粒体出现在40～42 组分中, 密度介于1.1685～1.1801 之间。
  附录：
  －－－－－－－－－－－－－－－－－
  梯度材料的应用范围
  　　⑴蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。
  　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
  　　⑶氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。
  　　⑷卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
  　　⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。