【求助】这到底是怎么回事啊？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-05 11:10 作者: bs4665 来源: 分析测试百科网

各位大侠好啊，我遇到非常难过的问题啦。
我最近在表达一个蛋白，载体是pET21b，宿主菌为BL21，我采用的是BamH1和Sal1位点，我的基因大小为759bp，表达的氨基酸为29kDa，所有的PCR，单切双切以及测序结果都正确，也带上有组氨酸标签，就是经过IPTG诱导后，却在50kDa处有大量的表达蛋白出现而不是29kDa处有，奇怪啊。在我的基因读码框前就还带有载体上的19个氨基酸，就算大的话也不能多出20kDa呢。大家有遇到过这样的情况么，真整不了了，请高手给点拨点拨吧，拜托了！

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ffaa (2014-4-05 11:11:01)

你在构建的时候，BamHI 位点和你的目的基因之间加了一个碱基（减了两个碱基）吗？否则就移码了。你说你的基因是759 bp，正好是3的倍数。如果正好是你的ORF，那就移码了。
比如你的基因是：ATGGGCGGATGCC---------CCATGGGTCCAATGA
那么你要插入的应该是：
X + ATGGGCGGATGCC---------CCATGGGTCCAA, X=3n + 1, n 可以为负整数。
图谱在这里，自己再好好看看哈，我的意见仅供您参考。
cuturl('http://wolfson.huji.ac.il/expression/commercial-vectors/pet-21-map.pdf')
bs4665 (2014-4-05 11:11:25)

我在BamHI 位点后面和我的目的基因起始密码子之前多加了一个G，正好读通，没有发生移码。而且测序的结果也可以看出在组氨酸标签的后面有终止了。
ffaa (2014-4-05 11:13:01)

那么建议先用His tag纯化，如果能纯化出来，测序结果又是对的，可以初步判断应该是你的蛋白；
如果有activity assay，可以辅助判断是否是你的蛋白；
如果有antibody，也可以进行判断；
可以考虑跑变性胶看看是否是dimer；
表观分子量与实际分子量不同的例子很多。如果实在不放心可以做个质谱鉴定。
standup (2014-4-05 11:14:03)

楼主确定使用的是 pET21 质粒吗？
确定是 BL21 宿主，而不是 BL21(DE3) 宿主吗？
如果有电泳图贴上来就更好了。
bs4665 (2014-4-05 11:14:52)

我用的是BL21（DE3），这是我的电泳图谱，SDS-PAGE，12%分离胶，4% 浓缩胶，最右边的为低分子量蛋白Marker，从上到下一次为96，66，45，31kDa，右边第一个泳道为空载体pET21质粒在BL21（DE3）中的蛋白对照，第二道第六泳道为我的五个克隆分别作的诱导表达，诱导出来的蛋白都在50左右，而不是在29kDa处。

13236088.jpg
bs4665 (2014-4-05 11:16:31)

我也考虑了是不是形成二聚物了，我在煮样时加了有1MD的氯化钠，企图打开二聚物间的分子作用力，但是结果却是和上图一样的，没有出现小的30左右的蛋白，就是说氯化钠没有起作用。
我在想是不是明天再用尿素处理一下再跑电泳看看。不知道amberly说的变性胶是怎么一回事，能说具体些么，说出来我去实践一下，有了结果拿出来再跟大家一起共勉和分享。
bs4665 (2014-4-05 11:17:07)

再有一点，怎么处理可以使两个相同单体形成的蛋白二聚物打开呢，如果有麻烦告知，我想知道到底是不是形成二聚物了。我刚才又想了一下，用尿素处理的话，会不会全部都打开成单链了呢，不知道是否还能看出来，晕了！
bs4665 (2014-4-05 11:17:54)

刚才又给测序后的序列翻译了一下，跟原始基因白表达的蛋白也是一致的，就是去了终止子，带上组氨酸标签后终止的。
standup (2014-4-05 11:18:43)

对不起，我想说非变性胶Smile
standup (2014-4-05 11:19:00)

请问是否预染marker？
bs4665 (2014-4-05 11:19:49)

不是预染marker，就是普通的低分子量蛋白marker