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【求助】MagneGST Protein Purification System及相关问题？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-05 17:32 作者: xevin 来源: 分析测试百科网

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【求助】MagneGST Protein Purification System及相关问题？

我想做蛋白的纯化和回收，可是对这方面的知识了解不多，请各位给我一些好的建议，问题有：
1.用什么样的蛋白回收纯化试剂盒较好？
2.我是想在跑完SDS-PAGE后，直接就从凝胶上回收，回收的蛋白产物是GST融合蛋白，我在网上看到有介绍MagneGST Protein Purification System试剂盒的，请问谁有此试剂盒的中文说明书，
3.表达的蛋白是332个氨基酸，但是没有查到此蛋白的分子量，请问GST加上我表达的蛋白332个氨基酸形成的融合蛋白的分子量推测该有多少分子量？
谢谢大家的帮助！

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【求助】MagneGST Protein Purification System及相关问题？

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12xunmei (2014-4-05 17:32:43)

QUOTE:
原帖由 xevin 于 2014-4-5 17:32 发表

我想做蛋白的纯化和回收，可是对这方面的知识了解不多，请各位给我一些好的建议，问题有：
1.用什么样的蛋白回收纯化试剂盒较好？
2.我是想在跑完SDS-PAGE后，直接就从凝胶上回收，回收的蛋白产物是GST融合蛋白，我在网上看到有介绍 ...
1、直接用GST亲和层析，说明书见附件
2、目的蛋白分子量在46K D左右，加上GST应该在72k D左右
xevin (2014-4-05 17:33:10)

你好！请问你是如何推测我的目的蛋白分子量是46KD左右的，有没有计算公式呀？谢谢你的帮助。
12xunmei (2014-4-05 17:33:51)

一般一个氨基酸的分子量在110左右，据此当然可推测出你的蛋白分子量喽。(不好意思，前面写错了，应该是36kD，和62kD。)
其实，你还可通过相关文献或网站查到相关分子量，或通过编码该蛋白的基因碱基对数目推测出蛋白的分子量。
wanglaoshi (2014-4-05 17:34:17)

我用的MagneGST™ Protein Purification System 是Promega公司的，但是不知道怎么回事，洗脱的蛋白量很少，而且多少还有杂带。
谁知道怎么处理可以教以下撒，谢谢！
12xunmei (2014-4-05 17:34:39)

QUOTE:
原帖由 wanglaoshi 于 2014-4-5 17:34 发表

我用的MagneGST™ Protein Purification System 是Promega公司的，但是不知道怎么回事，洗脱的蛋白量很少，而且多少还有杂带。
谁知道怎么处理可以教以下撒，谢谢！ ...
请将你的详细亲和洗脱过程写下来，可能可以帮你找找问题。
wanglaoshi (2014-4-05 17:35:21)

QUOTE:
原帖由 12xunmei 于 2014-4-5 17:34 发表

请将你的详细亲和洗脱过程写下来，可能可以帮你找找问题。
一磁珠平衡
（1）重悬，混匀GST磁珠
（2）加100ulGST磁珠于1.5mlEP管中
（3）放EP管于磁架上，使磁珠被吸附
（4）小心移弃上清
（5）取下EP管加250ulBinding/Washing Buffer，重悬磁珠
（6）重复3－5步3次
二Binding
1 洗完后加250ulBinding/Washing Buffer，重悬磁珠
2加入50ul超声破碎后上清（保证最终体积300ul,不足补Binding/Washing Buffer）
3混匀，4℃温和振荡30分钟
三 Washing
1放EP管于架子上，使磁珠被吸附
2小心取出上清，保留，并SDS-PAGE检测
3移下EP管，加250ulBinding/Washing Buffer，混匀，室温放置5分钟
4放EP管于架子上，使磁珠被吸附
5小心取出上清，保留，并SDS-PAGE检测
6移下EP管，加250ulBinding/Washing Buffer，混匀
7放EP管于架子上，使磁珠被吸附
8小心取出上清，保留，并SDS-PAGE检测
9重复6－8步3次
四 Elution
1 最后一次洗涤后，加200ulElution
2 4℃温和混匀15分钟
3放EP管于架子上，使磁珠被吸附
4小心移取上清，上清含有GST融合蛋白
5 若第二次提取必须，可重复1－4步
Smile
Binding/Wash Buffer
4.2mM Na2HPO4
2mM K2HPO4
140mM NaCl
10mM KCl调PH值为7.4，放4℃冰箱
Elution Buffer
50mM Glutathione (pH 7.0–8.0)
50mM Tris-HCl (pH 8.1)分别调PH，然后混合分装放入－80℃冰箱。
Evil
因为按步骤感觉纯化量太少，就用了600ul的磁珠，在Binding时加的全是上清，孵育时间是半小时到1小时之间。洗脱时间是半小时，同时，洗脱液用800ul。纯化带还是比较不错的。但是就是有杂带。
而且感觉洗涤对我的蛋白好像没多大效果。我蛋白的PH是5.26，不知道和这有关系没有？
本来打算附上纯化说明书，但是太大啦，不会传
12xunmei (2014-4-05 17:35:53)

我们实验室用的是GST琼脂糖凝胶，不是磁珠。
从我们的经验来看(可能不适合于GST磁珠，供参考)
1、超声破碎后上清的量应加大(一般要5-10倍于柱床体积)
2、要保证超声破碎后上清中含有相当浓度的具活性的GST融合蛋白
3、孵育时间可适当延长，甚至4度过夜，并伴有温和振荡
4、Elution Buffer：在Tris-HCl中加入还原性GSH后最好重新调pH
仅供参考。
fqswdzd (2014-4-05 17:36:57)

QUOTE:
原帖由 12xunmei 于 2014-4-5 17:35 发表

我们实验室用的是GST琼脂糖凝胶，不是磁珠。
从我们的经验来看(可能不适合于GST磁珠，供参考)
1、超声破碎后上清的量应加大(一般要5-10倍于柱床体积)
2、要保证超声破碎后上清中含有相当浓度的具活性的GST融合蛋白
3、 ...
2、要保证超声破碎后上清中含有相当浓度的具活性的GST融合蛋白
请问这个怎么确定啊？
12xunmei (2014-4-05 17:37:23)

一是通过电泳可以基本判断蛋白的表达量，还有就是要新鲜制备上清液。