【求助】有没有用过Qiagen Ni-NTA Spin Kit 试剂盒的朋友？

最新回复

• bling (2014-4-05 19:31:43)

  
  哪里迷糊了，拿出来说说，要不把说明书贴上来

• cocacola (2014-4-05 19:32:05)

  
  具体操作指南你可以在Qiagen网站上下载到，可以说比较详细了。
  用过这个试剂盒，无论在自然状态下纯化，还是在变性条件下纯化，都比较方便。离心的时候，尽量用最低的转速；如果在变性条件下纯化，要调好溶液的pH值。

• shkudo (2014-4-05 19:32:41)

  
  您好! 我刚开始从事这个纯化实验，很多问题不是很懂，希望您多多指点！
  1.我纯化出蛋白后要作为抗原免疫兔子，我是在变性条件下纯化好还是在非变性条件下好呢？
  2.我以前用过MN试剂盒，很简单，收集菌体后直接加上试剂盒的缓冲液超声波处理，离心后取上清过柱子，加上试剂盒的wash buffe冲洗，然后洗脱。只是纯度不是很高，听说这个Qiagen的试剂盒很好用，可是是不是还要自己配制缓冲液啊？
  3.超声处理前要加上蛋白酶抑制剂吗？
  4.能大体给我说一下您当时处理的步骤吗？
  5.在提高纯化蛋白的纯度上有什么经验吗？
  谢谢您了！

• cocacola (2014-4-05 19:33:41)

  1 你蛋白表达是可溶性表达呢还是包涵体表达，如果是可溶性，你就非变性条件下纯化，如果是包涵体，你就在变性条件下纯化
  2 自己配制缓冲液，哪个说明书上也应该有推荐缓冲液。我记得常规是Tris，NaCl，甘油，咪唑等
  3 一般加些PMSF就可以了
  4 加缓冲液重悬，加PMSF，冰上超声破碎，高速离心去除细胞碎片，上清过柱纯化
  5 先用少量介质摸索纯化条件，不同咪唑浓度洗脱，一般Ni柱纯化达到70%以上浓度，做抗原免疫兔子也差不多了，若有可能，再过个分子筛，纯度更高些

• gogo (2014-4-05 19:34:25)

  一般有条件的话,还是就买填料,自己装柱纯化,摸些条件,一般镍柱纯化纯度都能达到85%以上;表达量大的话,一般都能达到95%.
  对于国内公司招收技术人员时,如果做蛋白的都没自己装过镍柱,或都不知道洗脱液的成分什么的话,这是说不过去的啊!

• shkudo (2014-4-05 19:36:19)

  谢谢，我有点明白了~
  1.我的蛋白是可溶性的，在非变性条件下就可以了。
  2.把试剂盒里的尿素和咪唑加到磷酸钠储液配制成不同的浓度作为wash buffer 和elution buffer 。
  3.我加蛋白酶抑制剂吧，实验室正好有。
  谢谢了
  还有，重悬菌体时是加wash buffer 呢还是自己配制PBS好一些呢？

• shkudo (2014-4-05 19:37:13)

  
  谢谢了，还有个问题：我用试剂盒里的Elution Buffer洗脱下目的蛋白后可以直接和完全佐剂乳化吗？

• cocacola (2014-4-05 19:37:38)

  谢谢，我有点明白了~
  1.我的蛋白是可溶性的，在非变性条件下就可以了。
  2.把试剂盒里的尿素和咪唑加到磷酸钠储液配制成不同的浓度作为wash buffer 和elution buffer 。
  3.我加蛋白酶抑制剂吧，实验室正好有。
  谢谢了
  还有，重悬菌体时是加wash buffer 呢还是自己配制PBS好一些呢？
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  如果是可溶性的，你就不用加尿素了，切忌切忌
  Wash Buffer成分呢？一般可以用Wash Buffer重悬破菌

• bluelake (2014-4-05 19:46:48)

  谢谢:
  谢谢了，还有个问题：我用试剂盒里的Elution Buffer洗脱下目的蛋白后可以直接和完全佐剂乳化吗？
  最好透析脱个盐和咪唑
  我有超滤管，超滤一下就可以了吧？透析时损失是应该很多，我的蛋白不多。

• 3648755 (2014-4-05 19:49:16)

  
  也可以，超滤时，多稀释几次