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【求助】help! 2D的蛋白抽提和定量

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-08 17:10    作者: huifeng0516    来源: 分析测试百科网

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【求助】help! 2D的蛋白抽提和定量

各位作双向电泳的高手们，给点意见吧
我是刚开始做双向，是做细胞的，蛋白抽提不好，一定要买试剂盒吗？老板的意见是不给买，唉，基础银子少啊！蛋白定量是用的Bradford法，但按照这个定量蛋白点很少，所以想看一下有没有具体的步骤，是不是我的方法不对，谢谢！
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  • fsdd817 (2014-4-08 17:10:52)


    用1mg/mlBSA 25ug/ml 75 ug/ml 100 ug/ml 125 ug/ml 150 ug/ml 175 ug/ml 200 ug/ml
    做好标准曲线就可以测了

  • huifeng0516 (2014-4-08 17:11:09)

    我是用得100ug/ul,200，400，600，800，1000的标准品，应该只要作出标准曲线就可以啊，我想问一下你们的Bradfordfa法具体是怎么操作的呢？之前我看过网上有的人还加氯化钠的，你们家吗？

  • 831226 (2014-4-08 17:11:27)


    2D蛋白定量一般都用RC DC Bradford法(Bio-rad)(Reducing agent,Detergent agent都要兼容的定量方法,其实就是定量过程中有一个沉淀蛋白、干燥蛋白、再溶蛋白的过程.),常规的Bradford法不准确.
    裂解液随便自己配了,根本不用买.

  • fei1226com (2014-4-08 17:34:23)


    Bradford法最好用酶标仪测，普通的分光光度计误差太大！！

  • ladyhuahua (2014-4-08 17:34:51)


    工作也的线性范围是20ug/ml -200 ug/ml 用水稀释后制作标准曲线一般用1mg/mlBSA 稀释成25ug/ml 75 ug/ml 100 ug/ml 125 ug/ml 150 ug/ml 175 ug/ml 200 ug/ml 不用加nacl

  • 49888 (2014-4-08 17:35:29)

    正如楼上说的2d一般用RC DC Bradford法(Bio-rad) 用 Bradford 和BCA都不太好 裂解液中的chaps dtt等会影响显色的 我做过对比试验，而且影响比较大。 RC DCBradford kit比较贵估计你们也不会买，曾经用lysis做blank好像还可以不过要稀释你的样品，最近在准备自己沉淀蛋白用bradford测定看看 不过还没有做 因为重溶液不知道用什么的好 怕一样影响显色 ，不知道楼上对重溶液有什么看法

  • huifeng0516 (2014-4-08 17:35:55)


    谢谢大家，

    我感觉只用Bradford也是不太准确，用lysis做blank的话，那样品和标准品也要用lysis配置吗？

  • flower-201 (2014-4-08 17:37:01)


    恩 我以前是这么做的 标准可以基本呈线性 但是要稀释lysis 测量的结果还是在我预测的范围内，不过还是不确定准不准。
    想用沉淀的方法 在重溶做 不过没有用过RC DC Bradford法(Bio-rad) 的试剂盒不知道重溶的试剂是什么 有人要是用过回个贴看看

  • huifeng0516 (2014-4-08 17:37:20)


    谢谢，我也尝试做一下看看结果如何
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